Live Cell Imaging von F-Aktin Dynamics über Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Zusammenfassung

Selection, Mikroinjektion, und Bildgebung von fluoreszenzmarkierten F-Aktin über fluoreszierende Speckle-Mikroskopie (FSM).

Zusammenfassung

In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung von fluoreszierenden Speckle Microscopy (FSM), um hochauflösende Bilder der Aktindynamik in PtK1 Zellen zu erfassen. Ein einzigartiger Vorteil der FSM ist seine Fähigkeit, die Bewegung und Umsatz Kinetik (Montage / Demontage) der F-Aktin-Netzwerk innerhalb lebender Zellen zu erfassen. Diese Technik ist besonders nützlich bei der Ermittlung quantitativer Messungen von F-Aktin-Dynamik, wenn sie mit Computer-Vision-Software (qFSM) gepaart. Wir beschreiben die Auswahl, die Mikroinjektion und Visualisierung von Fluoreszenz-Aktin-Sonden in lebenden Zellen. Wichtig ist, dass ähnliche Verfahren für die Visualisierung von anderen macomolecular Baugruppen. FSM hat für Mikrotubuli, Intermediärfilamente und Haftung Komplexe nachgewiesen.

Protokoll

Abschnitt 1: Beziehen Sie Ihre fluoreszenzmarkierten Aktin für FSM

Benötigte Materialien: gereinigtem Aktin, Fluorophor (Alexa, X-Rhodamin empfohlen). G-Puffer, Ultrazentrifuge

1. Eine wichtige Komponente für den Erwerb guter FSM Filme erfordert die korrekte Kennzeichnung von Aktin (oder andere Zytoskelettproteine) mit dem Fluorophor Ihrer Wahl.
   Wir empfehlen die Verwendung von Fluorophoren Alexa (488, 568 Wellenlängen) und X-Rhodamin Succinimidylester Derivate, die Lysinreste ausgesetzt Ziel auf der Oberfläche von Aktin.
2. Bei der Wahl Ihres Fluorophor und seiner entsprechenden Wellenlänge, sicherzustellen, dass Ih....

Diskussion

Mehrere wichtige Faktoren sind entscheidend für die erfolgreiche Bilder Speckle erhalten, beginnen aber gute Speckles und enden mit der Qualität Ihrer fluoreszenzmarkierten Aktin. Ein hoher Kennzeichnung von Farbstoff an Aktin-Monomer, um 0,4 bis 0,7 eingestellt wird sichergestellt, dass Flecken erscheinen hell und diskret, während das markierte Protein selbst sollte löslich und frei von Aggregaten. Ebenso wichtig ist die Mikroinjektion Verfahren. Um normalen Zell-Homöostase (und Überleben), müssen Zellen mit einer geri.......

Materialien

Injektionspuffer (IB)
50 mM Kalium-Glutamat
0,5 M MgCl2 (Anlage 2a)
Speichern Sie bis zu 2 Jahre bei -20 ° C

 

G-Puffer
2 mM Tris ⋅ Cl, pH 8,0 (Anhang 2a)
0,2 mM CaCl2 (Anlage 2a)
Fügen Sie unmittelbar vor dem Gebrauch:
0,2 mM ATP (siehe Rezept für 100 mM)
0,5 mM 2-Mercaptoethanol

Speichern Sie bis zu 1 Tag bei 4 ° C