Chromosomale Spread Voorbereiding van menselijke embryonale stamcellen voor Karyotypering
Summary
Karyotypering is een eenvoudige en nuttige techniek op grote schaal gebruikt voor het opsporen van genetische veranderingen. Hier beschrijven we een stap voor stap protocol voor het chromosoom verspreiden bereiding van menselijke embryonale stamcellen voor het toezicht op de chromosomale status van deze cellen behouden in cultuur.
Abstract
Hoewel de menselijke embryonale stamcellen (hESC) is aangetoond dat een stabiele diploïde karyotype 1 aanwezig is, hebben vele studies blijkt dat, afhankelijk van de kweekomstandigheden ze gevoelig zijn voor chromosomale afwijkingen zoals het toevoegen van geheel of delen van de chromosomen te verwerven. Inderdaad, tijdens langdurige cultuur, karyotypic veranderingen waargenomen als enzymatische of chemische dissociatie worden gebruikt 2,3,4, terwijl de handleiding dissectie van kolonies voor de passage behoudt een stabiele karyotype 5. Trouwens, veranderingen in de omgeving, zoals het verwijderen van feeder-cellen lijken ook de genetische integriteit van hESC 3,6 compromis. Zodra chromosomale veranderingen van invloed kunnen zijn cellulaire fysiologie, van cruciaal belang gezien hESC is het karakteriseren van de genetische integriteit van hESC in vitro als een essentieel instrument in de embryogenese studies en drugs testen. Verder is het voor de toekomstige therapeutische doeleinden chromosomale veranderingen zijn een echte zorg omdat het vaak is gekoppeld aan kanker.
Hier laten we een eenvoudige en handige methode om een hoge kwaliteit chromosoom spreads te verkrijgen voor verdere analyse van de chromosomen die door G-banding, FISH, lucht of de CGH technieken 7,8. Wij raden u aan de chromosomale-status routinematig met tussenpozen van vijf passages in om het uiterlijk van translocaties en aneuploïdieën te controleren
Priscila Britto en Rafaela Sartore droegen evenzeer voor het papier.
Protocol
Discussion
De voorbereiding van chromosoom spreads is een cruciale stap voor een succesvolle analyse van de genetische status van embryonale stamcellen door routinematig technieken zoals G-banding, en meer geavanceerde technieken zoals FISH, hemel en CGH.
Deze procedure kan worden toegepast voor veel soorten cellen door het variëren van de periode van colcemid incubatie, die afhankelijk is van de celcyclus lengte. Voor de kolonies van embryonale stamcellen, we wachten drie uur, terwijl voor embryoid i…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 15 ml centrifuge tube | TPP | 91015 | ||
| Colcemid Karyo MAX | Gibco | 15212-012 | ||
| EDTA | Isofar | 721 | ||
| Glacial acetic acid | Isofar | 100 | ||
| Methanol | Isofar | 208 | ||
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104.931.000 | ||
| Slide | Bioslide | 7105-1 | ||
| Tripsin | SIGMA | T4799 |
Referenzen
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).
- Draper, J. S. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).
- Maitra, A. Genomic alterations in cultured human embryonic stem cells. Nat Genet. 37 (10), 1099-1099 (2005).
- Mitalipova, M. M. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-19 (2005).
- Buzzard, J. J., Gough, N. M., Crook, J. M., Colman, A. Karyotype of human ES cells during extended culture. Nat Biotechnol. 22 (4), 381-381 (2004).
- Caisander, G. Chromosomal integrity maintained in five human embryonic stem cell lines after prolonged in vitro culture. Chromosome Res. 14 (2), 131-131 (2006).
- Imreh, M. P. In vitro culture conditions favoring selection of chromosomal abnormalities in human ES cells. J Cell Biochem. 99 (2), 508-508 (2006).
- Robin-Wesselschmidt, J. L., Loring, J. F., Robin-Wesselschmidt, J. L., Robin-Wesselschmidt, S. c. h. w. a. r. t. z. . Human Stem Cell Manual. , 59-59 (2007).
- Rooney, D. E. . Human Cytogenetics. , (2001).
- Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T., Heslop-Harrison, P., Schwarzacher, T. . Practical in situ hybridization. , 51-51 (2000).
