Karyotypisierung ist eine einfache und nützliche Technik allgemein zum Nachweis genetischer Veränderungen verwendet. Hier beschreiben wir Schritt für Schritt-Protokoll für das Chromosom verteilt Vorbereitung von menschlichen embryonalen Stammzellen für die Überwachung der chromosomalen Status dieser Zellen in Kultur gehalten.
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Methodenartikel
Chromosomale Spread-Vorbereitung von humanen embryonalen Stammzellen für die Karyotypisierung
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Obwohl humanen embryonalen Stammzellen (hES) haben gezeigt worden, um eine stabile diploide Karyotyp 1 vorliegt, haben viele Studien berichteten, dass je nach Kulturbedingungen sie anfällig für chromosomale Anomalien wie Addition von ganzen oder Teile von Chromosomen zu erwerben sein. In der Tat, während der langfristigen Kultur, karyotypischen Veränderungen beobachtet werden, wenn enzymatische oder chemische Spaltung 2,3,4 verwendet werden, während die manuelle Zerlegung der Kolonien für die Passage behält eine stabile Karyotyp 5. Neben Veränderungen in der Umgebung wie die Entfernung von Feeder-Zellen scheinen auch die genetische Integrität der hESC 3,6 Kompromiss. Sobald chromosomalen Veränderungen beeinflussen könnten zelluläre Physiologie, ist die Charakterisierung der genetischen Integrität der hESC in vitro entscheidend angesichts hESC als wesentliches Instrument in der Embryogenese Studien und Drogentests. Darüber hinaus für zukünftige therapeutische Zwecke chromosomalen Veränderungen sind ein echtes Problem, wie es häufig zur Krebsentstehung verbunden.
Hier zeigen wir eine einfache und nützliche Methode, um qualitativ hochwertige Chromosom Spreads für die anschließende Analyse des Chromosoms von G-banding, FISH, SKY oder CGH-Techniken 7,8 eingestellt zu erhalten. Wir empfehlen die Überprüfung der chromosomalen Status routinemäßig mit Intervallen von 5 Passagen, um das Auftreten von Translokationen und Aneuploidien Monitor
Priscila Britto und Rafaela Sartore trugen zu gleichen Teilen auf das Papier.
Protokoll
EQUIPMENT
- Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C, 5% CO 2
- Zentrifuge
- Set von micropipettors (100, 100 &mgr;)
- Wasserbad 37 ° C
- Wasserbad 90 ° C bis Dampfquelle Wasser
- Phasenkontrast-Mikroskop
FIRST STEP
Die Behandlung der Zellen mit Colcemid
In diesem Verfahren verwendeten wir die hESC line H9 auf embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) mit Mitomycin C (Sigma) inaktiviert und gepflegt in DMEM/F12 (Invitrogen) kultiviert, ergänzt mit 20% Knockout Serumersatz (KSR, Gibco) und 8ng/mL der Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF-2,....
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Diskussion
Die Vorbereitung des Chromosoms verbreitet ist ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche Analyse des genetischen Status von embryonalen Stammzellen durch die routinemäßig Techniken wie G-banding, und anspruchsvollere Techniken wie FISH, SKY und CGH.
Dieses Verfahren kann für viele Zelltypen durch Variation der Zeit der Colcemid Inkubation, die auf der Dauer des Zellzyklus hängt angewendet werden. Für Kolonien von embryonalen Stammzellen, warten wir 3 Stunden, während für Embryoidkörpern (E.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 15-ml-Zentrifugenröhrchen | Techno Plastic Products | 91015 | |
| Colcemid Karyo MAX | GIBCO, by Life Technologies | 15212-012 | |
| EDTA | Isofar | 721 | |
| Essigsäure, rein | Isofar | 100 | |
| Methanol | Isofar | 208 | |
| Kaliumchlorid (KCl) | Merck & Co., Inc. | 104.931.000 | |
| Objektträger | Bioslide | 7105-1 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4799 |
Referenzen
- Thomson, J. A. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1145 (1998).
- Draper, J. S. Recurrent gain of chromosomes 17q and 12 in cultured human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 22 (1), 53-53 (2004).
- M....
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Nachdrucke und Genehmigungen
