Mess-Plasmamembranprotein endocytischen Preise von Reversible Biotinylierung

Zusammenfassung

Regulierte Endozytose regelt die Zelloberflächenexpression Ebenen der Mehrheit der Membranproteinen. Hier nutzen wir reduzierbar, Membran impermeante Biotinylierungsreagenzien die endocytischen Rate der Dopamin-Transporter (DAT), ein polytoper Membranprotein zu messen. Das Verfahren ermöglicht eine einfache Methode zur Messung der Endozytose von den meisten Plasmamembranproteinen.

Zusammenfassung

Plasma-Membran-Proteine ​​sind eine große, heterogene Gruppe von Proteinen, Rezeptoren, Ionenkanäle, Transporter und Pumpen umfasst. Die Aktivität dieser Proteine ​​ist verantwortlich für eine Vielzahl von Schlüsselbegriffen zellulären Ereignissen, einschließlich Nährstoffzufuhr, zelluläre Erregbarkeit und chemische Signalisierung. Viele Plasmamembranproteinen werden dynamisch von endocytischen Menschenhandel, die Funktion von Proteinen moduliert durch die Veränderung Proteinoberfläche Ausdruck geregelt. Die Mechanismen, die Protein Endocytose zu erleichtern, sind komplex und nicht vollständig für viele Membranproteine ​​verstanden. Um das Verständnis der Mechanismen, die die endocytischen Handel mit einem bestimmten Protein-Steuerung, ist es entscheidend, dass das Protein s endocytischen Rate präzise gemessen werden. Für viele Rezeptoren, sind direkte endocytischen Rate-Messungen häufig erreicht Verwendung markierter Rezeptor-Liganden. Doch für viele Klassen von Membranproteinen, wie etwa Transporter, Pumpen und Ionenkanäle, gibt es keine passende Ligand, mit dem die endocytischen Rate gemessen werden kann. In dem vorliegenden Bericht beschreiben wir eine reversible Biotinylierung Methode, die wir einsetzen, um die Dopamin-Transporter (DAT) endocytischen zu messen. Diese Methode stellt eine einfache Methode zur Messung von Internalisierung Raten und kann leicht für den Handel mit Studien der meisten Membranproteine ​​eingesetzt werden.

Protokoll

Vorgehensweise im Überblick:

Mit diesem Ansatz sind Zelloberfläche Proteine ​​kovalent mit Biotin auf den verfügbaren extrazellulären Lysin-Reste mit einer Membran impermeante, Disulfid-gekoppelten Biotinylierungsreagenz (Sulfo-NHS-SS-Biotin) unter Menschenhandel restriktiven Bedingungen (zB bei niedriger Temperatur) bezeichnet (siehe Abb.. 1 zur Illustration). Eine Gruppe von Zellen zur Bekämpfung permissiven Bedingungen verschoben (37 ° C) und biotinylierte Proteine ​​zu verinnerlichen. Die andere Gruppe von Zellen bei niedriger Temperatur als Kontrollen für 1) die gesamte Oberfläche Protein zur Zeit = 0, und 2) stripping Kontrolle gehalt....

Diskussion

Häufige Probleme: Das häufigste Problem, dass bei diesen Versuchen ergibt sich ist schlecht Streifen Effizienz. Die Effizienz des Streifens ist von entscheidender Bedeutung in der Lage, die Ergebnisse zu interpretieren. Sofern der Streifen wurde hocheffiziente, ist es nicht möglich festzustellen, dass jeder biotinylierten Proteinen in die Internalisierung Gassen, waren in der Tat, verinnerlicht von der Oberfläche. Strips ≥ 90% Wirkungsgrad sind optimal, und wir verwerfen Ergebnisse, wenn die Streifen unter diesen.......