אנדוציטוזה מוסדרים מסדיר את שטח פני התא רמות הביטוי של רוב חלבונים בממברנה. כאן אנו מנצלים פריק, impermeant קרום biotinylation ריאגנטים למדוד את קצב endocytic של טרנספורטר דופאמין (DAT), חלבון הממברנה polytopic. השיטה מאפשרת גישה פשוטה למדידת קצב endocytic של רוב החלבונים פלזמה הממברנה.
Abstract
חלבונים פלזמה הממברנה הם קבוצה גדולה, מגוונת של חלבונים מורכבת של קולטנים, תעלות יונים, מובילי ומשאבות. פעילות של חלבונים אלה אחראי למגוון של אירועים הסלולר מפתח, כולל אספקת חומרי מזון, רגישות הסלולר, ואותות כימיים. רבים קרום חלבונים פלזמה מוסדרים באופן דינמי על ידי סחר endocytic, אשר מודולציה תפקוד החלבון על ידי שינוי פני השטח ביטוי חלבון. המנגנונים המאפשרים אנדוציטוזה חלבונים מורכבים אינם מובנים במלואם עבור חלבונים בממברנה רבים. כדי להבין את המנגנונים ששולטים בסחר endocytic של חלבון מסוים, זה קריטי, כי שיעור endocytic של חלבון להימדד בדיוק. עבור קולטנים רבים, ישיר מדידות קצב endocytic מושגות לעתים קרובות ניצול ligands קולטן שכותרתו. עם זאת, עבור שיעורים רבים של חלבונים בממברנה, כגון מובילי, משאבות תעלות יונים, אין ליגנד נוח כי ניתן להשתמש כדי למדוד את קצב endocytic. בדו"ח הנוכחי, אנו מתארים שיטה biotinylation הפיך שאנו מעסיקים כדי למדוד את טרנספורטר דופאמין (DAT) שיעור endocytic. שיטה זו מספקת גישה פשוטה למדידת שיעורי הפנמה, והוא יכול בקלות להיות מועסק ללימודי סחר של חלבונים בממברנה ביותר.
Protocol
נוהל סקירה: בגישה זו, משטח חלבוני התא מסומנים קוולנטית על זמין ליזין ושאריות תאית באמצעות impermeant קרום, דיסולפיד מצמידים מגיב biotinylation (sulfo-NHS-SS-ביוטין) בתנאים מגבילים סחר (כלומר בטמפרטורה נמוכה) עם ביוטין (ראה איור 1. להמחשה). קבוצה אחת ש…
Discussion
בעיות נפוצות: הבעיה הנפוצה ביותר שעולה בניסויים אלה הוא יעילות רצועת עניים. את היעילות של הרצועה הוא קריטי להיות מסוגל לפרש את התוצאות. אם הרצועה היתה היעילה ביותר, לא ניתן להסיק כי כל החלבונים biotinylated בסמטאות הפנמה היו, למעשה, הפנימו מפני השטח. רצועות ≥ יעילות 90% ה?…