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Cancer Research

प्लुरिपोटेंसी के लिए अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा को पुन: प्रोग्रामिंग करना

Published: February 2, 2024 doi: 10.3791/65811
Automatic Translation
1,2, 3, 4, 4,5, 4,6, 3,6, 1
1Centre for Regenerative Medicine, Institute of Regeneration and Repair, Institute of Stem Cell Research, The University of Edinburgh, 2King Abdulaziz City for Science and Technology Health Sector (KACST), 3Cancer Early Detection Advanced Research Center, Knight Cancer Institute, Oregon Health & Science University, 4Brenden-Colson Canter for Pancreatic Care, Oregon Health & Science University, 5Department of Surgery, Oregon Health & Science University, 6Department of Molecular & Medical Genetics, Oregon Health & Science University

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल प्रेरित pluripotent स्टेम सेल में अग्नाशय डक्टल Adenocarcinoma (PDAC) और सामान्य अग्नाशय वाहिनी उपकला कोशिकाओं के reprogramming का वर्णन करता है. हम एक अनुकूलित और विस्तृत, चरण-दर-चरण प्रक्रिया प्रदान करते हैं, लेंटवायरस तैयार करने से लेकर स्थिर आईपीएससी लाइनों की स्थापना तक।

Abstract

प्रतिलेखन कारकों का उपयोग करके प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) की पीढ़ी लगभग किसी भी विभेदित सेल प्रकार से प्राप्त की गई है और अनुसंधान और नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए अत्यधिक मूल्यवान साबित हुई है। दिलचस्प बात यह है कि कैंसर कोशिकाओं के आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग, जैसे अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी), को आक्रामक पीडीएसी फेनोटाइप को वापस करने और कैंसर एपिजेनोम को ओवरराइड करने के लिए दिखाया गया है। PDAC-व्युत्पन्न IPSC का भेदभाव PDAC प्रगति को अपने प्रारंभिक अग्नाशयी intraepithelial नियोप्लासिया (PanIN) अग्रदूत से पुनरावृत्ति कर सकता है, PDAC प्रगति के दौरान जल्दी होने वाले आणविक और सेलुलर परिवर्तनों का खुलासा करता है। इसलिए, PDAC-व्युत्पन्न IPSC प्रारंभिक पहचान नैदानिक मार्करों की खोज के लिए PDAC के शुरुआती चरणों मॉडल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. यह पीडीएसी रोगियों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, जिन्हें आमतौर पर पहले पैनिन चरणों के लिए विश्वसनीय बायोमार्कर की कमी के कारण देर से मेटास्टेटिक चरणों में निदान किया जाता है। हालांकि, पीडीएसी सहित कैंसर सेल लाइनों को प्लुरिपोटेंसी में पुन: प्रोग्रामिंग करना चुनौतीपूर्ण, श्रम-गहन और विभिन्न लाइनों के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील रहता है। यहाँ, हम bicistronic lentiviral वैक्टर का उपयोग कर विभिन्न मानव PDAC सेल लाइनों से IPSC उत्पन्न करने के लिए एक और अधिक सुसंगत प्रोटोकॉल का वर्णन. परिणामस्वरूप IPSC लाइनों स्थिर हैं, reprogramming कारकों या inducible दवाओं के exogenous अभिव्यक्ति पर कोई निर्भरता दिखा. कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल पीडीएसी-व्युत्पन्न आईपीएससी की एक विस्तृत श्रृंखला की पीढ़ी की सुविधा प्रदान करता है, जो प्रारंभिक बायोमार्कर की खोज के लिए आवश्यक है जो पीडीएसी मामलों के अधिक विशिष्ट और प्रतिनिधि हैं।

Introduction

अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा (पीडीएसी) सबसे घातक विकृतियों में से एक है, और रोग की स्पर्शोन्मुख प्रकृति के कारण प्रारंभिक निदान चुनौतीपूर्ण रहता है। पीडीएसी रोगियों के बहुमत उन्नत मेटास्टेटिक चरण में निदान कर रहे हैं जब बहुत सीमित उपचार विकल्प 1,2 उपलब्ध हैं. यह मुख्य रूप से पहले के चरणों के लिए विश्वसनीय बायोमाकर्स की कमी के कारण है, जैसे कि वे जिन्हें रक्तप्रवाह में जारी प्रोटीन के रूप में आसानी से पता लगाया जा सकता है।

PDAC अपनी प्रगति के दौरान बहुत जल्दी प्रसार कर सकते हैं, और एक बेहतर रोग का निदान प्रारंभिक कैंसर का पता लगाने के लिए जोड़ा गया है जब PDAC अग्न्याशय3 में स्थानीयकृत है. हालांकि, पीडीएसी रोगियों के दसवें से भी कम एक अनुकूल रोग का निदान किया जाता है, जिससे सर्जिकल लकीर की अनुमति मिलती है। बहरहाल, रिसेक्टेबल ट्यूमर वाले कुछ लोग 12 महीने4 के भीतर ट्यूमर पुनरावृत्ति के लिए भी प्रवण होते हैं।

पिछले पांच दशकों में, शल्य चिकित्सा तकनीकों, रोगी देखभाल, और उपचारके तौर-तरीकों 5,6 में उल्लेखनीय सुधार किए गए हैं। हालांकि, शल्य चिकित्सा से पीड़ित पीडीएसी रोगियों में 5 साल की जीवित रहने की दर मुश्किल से 17% तक बढ़ी है। बहरहाल, यह अभी भी गैर-विच्छेदित रोगियों की तुलना में बेहतर है, जो लगभग अपरिवर्तित (0.9%)4,7बना हुआ है। कीमोथेरेपी एकमात्र अन्य वैकल्पिक पीडीएसी उपचार है। फिर भी, यह विकल्प बहुत सीमित है क्योंकि पीडीएसी रोगियों के महान बहुमत जेमसिटाबाइन 7,8 जैसे कीमोथेरेपी दवाओं के लिए मजबूत प्रतिरोध प्रदर्शित करते हैं। अन्य दवाएं, जैसे कि एर्लोटिनिब, केवल विशिष्ट उत्परिवर्तन वाले पीडीएसी रोगियों के एक छोटे समूह के लिए उपलब्ध हैं, जिनमें से अधिकांश एर्लोटिनिब प्रतिरोध9 दिखाते हैं। अधिकांश पीडीएसी रोगियों में कीमोथेरेपी से जुड़े प्रतिकूल दुष्प्रभाव इस उपचार का एक और नुकसान हैं10. हाल ही में, आशाजनक रणनीतियों से पता चला है कि प्रतिरक्षा चौकी अवरोधकों (आईसीआई) और छोटे अणु किनेज अवरोधकों (एसएमकेआई) पीडीएसी के इलाज में प्रभावी हो सकता है, लेकिन इन लक्षित उपचारों के लिए टिकाऊ प्रतिक्रियाएंरोगियों 11,12 के अल्पसंख्यक तक सीमित रहती हैं। कुल मिलाकर, पीडीएसी-विशिष्ट प्रारंभिक बायोमार्कर की खोज प्रारंभिक निदान और उपचार के लिए नए मार्ग प्रशस्त कर सकती है।

PDAC अग्नाशयी intraepithelial neoplasms (PanIN) अग्रदूत घावों है कि गैर इनवेसिव अग्नाशयी वाहिनी उपकला प्रसार13,14 से परिणाम से विकसित करता है. जबकि पैनआईएन का गठन केआरएएस जैसे ऑन्कोजीन म्यूटेशन द्वारा शुरू किया जाता है, पीडीएसी की प्रगति के लिए अतिरिक्त आनुवंशिक और एपिजेनेटिक परिवर्तन की आवश्यकता होती है। यह अनुमान लगाया गया है कि आक्रामक पीडीएसी में विभिन्न चरणों के माध्यम से पैनिन की प्रगति में लगभग 10 वर्ष लगते हैं 13,15,16,17. यह समय सीमा प्रारंभिक पीडीएसी निदान से लाभ उठाने का एक शानदार अवसर प्रदान करती है। इसलिए, पीडीएसी प्रगति 18,19,20,21का अध्ययन करने के लिए ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट पशु मॉडल और ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों को स्थापित करने के लिए व्यापक शोध किया गया है। ये मॉडल पीडीएसी के आक्रामक चरणों का अध्ययन करने के लिए बहुत उपयोगी रहे हैं, हालांकि शुरुआती पैनिन चरणों से संक्रमण नहीं। इसलिए, प्रयोगात्मक मॉडल विकसित करना महत्वपूर्ण है जो प्रारंभिक पहचान बायोमार्कर की खोज को सक्षम करने के लिए पैनिन चरणों की प्रारंभिक प्रगति को पुन: व्यवस्थित कर सकते हैं।

चार प्रतिलेखन कारकों OCT4, SOX2, KLF4, और c-MYC (OSKM) का उपयोग करके प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (IPSC) में दैहिक कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग ने सेलुलर प्लास्टिसिटी22 की सीमा को चित्रित किया है। कैंसर सेल प्लास्टिसिटी को अच्छी तरह से प्रलेखित किया गया है, और आईपीएससी में मानव कैंसर कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग करने के लिए कोशिकाओं को उनके मूल सेलुलर राज्य में रीसेट करने के लिए सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, कैंसर की प्रगति 23,24,25,26,27,28,29 के दौरान जमा हुए कई एपिजेनेटिक अपमान को हटा रहा है. कैंसर सेल पहचान में हेरफेर करने के लिए इस reprogramming रणनीति का उपयोग करने की संभावना है, इसलिए, कैंसर30,31 के इलाज में महान वादा प्रस्तुत किया है. दरअसल, हमने पहले दिखाया है कि पीडीएसी से व्युत्पन्न आईपीएससी का भेदभाव प्रारंभिक पैनआईएन चरणों32 के माध्यम से पीडीएसी प्रगति को पुन: व्यवस्थित कर सकता है। पीडीएसी के प्रारंभिक-से-मध्यवर्ती चरणों के लिए विशिष्ट जीन और मार्गों की पहचान करके, उम्मीदवार बायोमार्कर की पहचान की गई थी कि चिकित्सकीय प्रारंभिक पीडीएसी निदान 32,33के लिए उपयोग किया जा सकता है। हालांकि, बायोमार्कर एक एकल आईपीएससी लाइन का उपयोग कर की खोज पीडीएसी रोगियों32 के बहुमत में सीमित कवरेज से पता चला. अन्य PDAC रोगियों से IPSC लाइनों को उत्पन्न करने की चुनौतियों अधिक विश्वसनीय biomarkers की खोज करने की क्षमता रोक दिया है. यह ओएसकेएम वितरण की विषमता सहित कई तकनीकी कारकों के कारण है, क्योंकि मानव प्राथमिक पीडीएसी कोशिकाओं के केवल एक छोटे से हिस्से में सभी चार कारक शामिल थे और रीप्रोग्रामिंग के लिए सफलतापूर्वक प्रतिक्रिया दी गई थी। यहां, ओसकेएम के अधिक कुशल और सुसंगत दोहरी लेंटिवायरल डिलीवरी का उपयोग करके प्राथमिक पीडीएसी कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है।

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Protocol

सभी प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल OHSU संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किए गए थे. सभी तरीकों को प्रासंगिक दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार किया गया था। पीडीएक्स ट्यूमर के लिए सभी पशु कार्य ओएचएसयू संस्थागत पशु उपयोग और देखभाल समिति (आईएसीयूसी) की मंजूरी के साथ किए गए थे। इस प्रोटोकॉल का परीक्षण प्राथमिक पीडीएसी कोशिकाओं में रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) से किया गया था, बीएक्सपीसी 3 सेल लाइन जो एपिथेलियल आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करती है जो एडेनोकार्सिनोमा के साथ 61 वर्षीय महिला रोगी के अग्न्याशय ऊतक से अलग थी, एच 6 सी 7 सामान्य मानव अग्नाशयी वाहिनी उपकला से प्राप्त उपकला सेल लाइन, और स्वस्थ व्यक्तियों की त्वचा बायोप्सी से प्राप्त प्राथमिक मानव फाइब्रोब्लास्ट्स। मानव PDAC नमूने ओरेगन अग्न्याशय ऊतक रजिस्ट्री अध्ययन के तहत प्राप्त किए गए थे (IRB00003609). सभी विषयों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। मानव प्राथमिक फाइब्रोब्लास्ट आरबीओमेडिकल, एडिनबर्ग, यूके में एडिनबर्ग रॉयल इन्फर्मरी, लिटिल फ्रांस, यूके में नियमित सर्जरी से गुजरने वाले गुमनाम दाताओं से त्वचा के नमूनों से उनकी सहमति और नैतिक अनुमोदन (09 / एमआरई 00/91) के तहत प्राप्त किए गए थे। सभी लेंटवायरस कार्य कक्षा 2 अनुसंधान गतिविधि (जीएम 207 / 16.6) के तहत किए गए हैं और एडिनबर्ग विश्वविद्यालय में स्वास्थ्य और सुरक्षा विभाग द्वारा अनुमोदित किए गए हैं और स्कॉटिश सरकार के एचएसई सक्षम प्राधिकारी को अधिसूचित किया गया है। मानव अग्नाशय कोशिकाओं का उपयोग कर सभी reprogramming प्रयोगों एडिनबर्ग विश्वविद्यालय (संदर्भ # asoufi-0002) में जैविक विज्ञान नैतिकता समिति के स्कूल के नैतिक अनुमोदन के तहत किया गया.

1. लेंटिवायरस की तैयारी

  1. लेंटवायरस तैयारी के लिए, psPAX2, pMDG34, और दो RES युक्त बाइसिस्ट्रोनिक वैक्टर सहित 1-2 μg/μL के बीच सांद्रता के साथ उच्च गुणवत्ता वाली पैकेजिंग और अभिव्यक्ति प्लास्मिड (एंडोटॉक्सिन-मुक्त) तैयार करें; OCT4 और SOX2 अभिव्यक्ति के लिए pSIN4-EF1a-O2S एन्कोडिंग EF-1α प्रमोटर द्वारा संचालित, और KLF4 के लिए pSIN4-CMV-K2M और CMV एन्हांसर/प्रमोटर35 के तहत c-MYC अभिव्यक्ति ( सामग्री की तालिका देखें)। इसके अलावा, एक अभिकर्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए pWPT-GFP प्लाज्मिड तैयार.
  2. ग्लासगो के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (जीएमईएम) में मानव भ्रूण किडनी सेल लाइन (293 टी) और संस्कृति, 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस), 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट और 1 एमएम ग्लूटामाइन के साथ पूरक ( सामग्री की तालिका) 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2।
    नोट: विगलन के बाद चार मार्गों के भीतर 293T कोशिकाओं का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  3. बीज 293T प्रति 15 सेमी डिश 3 मिलियन कोशिकाओं के घनत्व पर, अभिकर्मक से पहले 24 घंटे। कुल तीन व्यंजनों की आवश्यकता होती है। यह दोपहर ~ 16:00 में बाद में बीज कोशिकाओं के लिए बेहतर है.
  4. अगले दिन (~ 16: 00), जब कोशिकाओं ~ 40% -50% संगम तक पहुँचने, तीन अभिकर्मक प्रतिक्रियाओं के लिए निम्नलिखित तैयार:
    नोट: हमेशा 10% वॉल्यूम अतिरिक्त जोड़कर पाइपिंग त्रुटि के लिए खाते हैं।
    1. उपयुक्त लेंटवायरस नाम (pSIN4-EF1a-O2S, pSIN4-CMV-K2M, और pwPT-GFP नियंत्रण) के साथ तीन 15 एमएल प्लास्टिक ट्यूबों को लेबल करें। प्रत्येक ट्यूब में 1.710 एमएल कम सीरम माध्यम ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें।
    2. 1.710 एमएल कम सीरम माध्यम में 90 माइक्रोन अभिकर्मक अभिकर्मक ( सामग्री की तालिकादेखें) पतला, 2 एस के लिए शीर्ष द्वारा मिश्रण, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं।
    3. पैकेजिंग वैक्टर मिलाएं; psPAX2 का 5.1 μg और pMDG का 2.4 μg (कुल 7.5 μg)।
    4. पैकेजिंग वेक्टर मिश्रण को अभिकर्मक माध्यम (चरण 1.4.2 से) और भंवर में 2 एस के लिए जोड़ें।
    5. प्रत्येक रिप्रोग्रामिंग वेक्टर के 7.5 माइक्रोग्राम जोड़ें: pSIN4-EF1a-O2S और pSIN4-CMV-K2M और pwPT-GFP नियंत्रण चरण (1.4.4) से अभिकर्मक मिश्रण और 2 s के लिए भंवर से नियंत्रण करें।
      नोट: अभिव्यक्ति वेक्टर का उपयोग करें: वायरल वेक्टर 1: 1 अनुपात में।
  5. कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए अभिकर्मक ट्यूबों सेते हैं.
  6. प्रत्येक लेंटवायरस के साथ 293T कोशिकाओं को सीधे चरण (1.4.5) से मीडिया में ड्रॉपवाइज फैशन में जोड़कर ट्रांसफ़ेक्ट करें। पूरी सतह पर समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए डिश को घुमाएं।
  7. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर रातोंरात इनक्यूबेट करें।
    नोट: वायरस-विशिष्ट अपशिष्ट, एक धातु निपटान बाल्टी, आटोक्लेव बैग के साथ डबल बैग का उपयोग करें, और वायरस के लिए एक तरल अपशिष्ट कंटेनर लें और एक कीटाणुनाशक टैबलेट जोड़ें। एक धातु की बाल्टी में सभी पिपेट, टिप्स और ट्यूबों का निपटान करें। पुराने मीडिया को वायरस-तरल अपशिष्ट कंटेनर में निपटाएं। आकस्मिक वायरस संदूषण को खत्म करने के लिए ग्लास पिपेट और कांच के बने पदार्थ का उपयोग करने से बचें।
  8. 14-16 घंटे के बाद अभिकर्मक के बाद, मध्यम को 30 एमएल ताजा 293T माध्यम से बदलें।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, मध्यम परिवर्तन के बाद 60-72 घंटे के लिए 5% सीओ2 । दैनिक कोशिकाओं का निरीक्षण करें और GFP प्रतिदीप्ति द्वारा अभिकर्मक दक्षता की जांच करें।
    नोट: आदर्श रूप से, अभिकर्मक दक्षता GFP द्वारा >90% होनी चाहिए। अन्य वायरस के लिए, किसी को 293T कोशिकाओं के स्पष्ट रूपात्मक परिवर्तनों का निरीक्षण करना चाहिए, क्योंकि वे वायरस कणों का उत्पादन करते समय अधिक गोल हो जाते हैं।
  10. 50 एमएल ट्यूबों में प्रत्येक वायरस अभिकर्मक संस्कृति से मीडिया लीजिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1932 x ग्राम पर सेल मलबे को साफ करने के लिए नीचे स्पिन करें।
  11. छोटे मलबे को हटाने और इसे नए 50 एमएल ट्यूबों में इकट्ठा करने के लिए 0.45 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर के माध्यम से प्रत्येक लेंटवायरस सतह पर तैरनेवाला फ़िल्टर करें।
  12. प्रत्येक लेंटवायरस सतह पर तैरनेवाला को 6 एमएल एलिकोट में विभाजित करें और तरल नाइट्रोजन में प्रत्येक को फ्रीज करें।
  13. उपयोग करने के लिए तैयार होने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर लेंटवायरस एलिकोट्स स्टोर करें।

2. लेंटवायरस ट्रांसडक्शन को पुन: प्रोग्राम करना

  1. पिघलना प्राथमिक पीडीएसी कोशिकाओं और संस्कृति पूरी तरह से परिभाषित केराटिनोसाइट सीरम फ्री मीडियम (केएसएफएम) में, गोजातीय पिट्यूटरी निकालने (बीपीई) के साथ पूरक, मानव पुनः संयोजक एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) 5 एनजी / एमएल पर, और हैजा विष 50 एनजी / एमएल में 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 5% ओ2 (हाइपोक्सिया) इनक्यूबेटर ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. पिघलना BxPc3, एक स्क्वैमस अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा सेल लाइन, और RPMI 1640 मध्यम में संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के साथ पूरक, और 5% CO2.
  3. पिघलना एच 6 सी 7 कोशिकाओं, अग्नाशयी डक्टल उपकला कोशिकाओं, और केएसएफएम में संस्कृति बीपीई और ईजीएफ के साथ 5 एनजी / एमएल पर, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर पूरक है।
  4. ग्लासगो के न्यूनतम आवश्यक माध्यम (जीएमईएम) में पिघलना मानव फाइब्रोब्लास्ट (एचएफआईबी) और संस्कृति, 10% एफसीएस, 1x गैर-आवश्यक अमीनो एसिड, 1 एमएम सोडियम पाइरूवेट और 1 एमएम ग्लूटामाइन, और 0.05 एमएम (अंतिम) बीटा-मर्काप्टोएथेनॉल 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर पूरक।
  5. लेंटवायरस पारगमन (अधिमानतः देर से दोपहर) से पहले एक दिन, पीडीएसी, बीएक्सपीसी 3, एच 6 सी 7, और एचएफआईबी कोशिकाओं में से प्रत्येक के प्रति 100,000 कोशिकाओं वाले 6-अच्छी प्लेट के दो कुएं तैयार करें। OSKM लेंटिवायरस के साथ एक को अच्छी तरह से संक्रमित करें और दूसरे को एक असंक्रमित नियंत्रण के रूप में उपयोग करें।
    नोट: प्रत्येक सेल प्रकार के लिए एक अलग प्लेट का उपयोग करें।
  6. अगले दिन, दोपहर में (लगभग 24 घंटे बाद), सुनिश्चित करें कि सेल संगम अगले लेंटवायरस संक्रमण कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले कम से कम 70% तक पहुंच जाता है।

3. PDAC का लेंटवायरस ट्रांसडक्शन

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस वायरस इनक्यूबेटर में प्रत्येक लेंटवायरस सतह पर तैरनेवाला के 5 एमएल डीफ्रॉस्ट।
  2. दो 15 एमएल ट्यूब, पूर्व गर्म पीडीएसी संस्कृति माध्यम के 2 एमएल युक्त प्रत्येक तैयार करें.
  3. पहली ट्यूब के लिए, प्रत्येक reprogramming lentivirus (pSIN4-CMV-K2M और pSIN4-EF1a-O2S) के 6 एमएल और 4.5 mg/mL polybrene के 12 μL (अंतिम 4.5 μg/mL, सामग्री की तालिकादेखें) और मिश्रण जोड़ें।
  4. दूसरी ट्यूब में, 4.5 मिलीग्राम/एमएल पॉलीब्रेन (अंतिम 4.5 माइक्रोग्राम/एमएल) के 2 माइक्रोन जोड़ें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से से माध्यम त्यागें और कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ एक बार धो लें.
  6. पहले अच्छी तरह से reprogramming संक्रमण मीडिया (ट्यूब 1) जोड़ें.
  7. ट्यूब 2 के मिश्रण को दूसरे कुएं में डालें। यह असंक्रमित नियंत्रण होगा।
  8. पीडीएसी कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 5% ओ2 (हाइपोक्सिया) इनक्यूबेटर में रातोंरात इनक्यूबेट करें।
  9. अगले दिन, दोपहर में, दोनों कुओं से मीडिया को त्यागें और इसे ताजा पीडीएसी संस्कृति माध्यम से बदलें।
  10. 48 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 5% ओ2 (हाइपोक्सिया) पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

4. BxPc3 कोशिकाओं का लेंटीवायरस पारगमन

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस वायरस इनक्यूबेटर में प्रत्येक लेंटवायरस सतह पर तैरनेवाला के 3 एमएल डीफ्रॉस्ट।
  2. दो 15 एमएल ट्यूब तैयार करें, प्रत्येक में बीएक्सपीसी 3 संस्कृति माध्यम के 2 एमएल हों।
  3. पहली ट्यूब के लिए, प्रत्येक reprogramming lentivirus (pSIN4-CMV-K2M और pSIN4-EF1a-O2S) और 4.5 mg/mL polybrene (अंतिम 4.5 μg/mL) के 6 μL के 3 एमएल जोड़ें और मिश्रण करें।
  4. दूसरी ट्यूब में, 4.5 मिलीग्राम/एमएल पॉलीब्रेन (अंतिम 4.5 माइक्रोग्राम/एमएल) के 2 माइक्रोन जोड़ें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से से माध्यम त्यागें और पीबीएस के साथ एक बार धो लें.
  6. पहले अच्छी तरह से reprogramming संक्रमण मीडिया (ट्यूब 1) जोड़ें.
  7. ट्यूब 2 के मिश्रण को दूसरे कुएं में डालें। यह असंक्रमित नियंत्रण होगा।
  8. संक्रमित BxPc3 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस वायरस और 5% सीओ2 रातोंरात इनक्यूबेट करें।
  9. अगले दिन, दोपहर में, दोनों कुओं से मीडिया त्यागें और इसे ताजा BxPc3 संस्कृति माध्यम से बदलें।
  10. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।

5. H6c7 कोशिकाओं के संक्रमण का लेंटवायरस पारगमन

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस वायरस इनक्यूबेटर में प्रत्येक लेंटवायरस सतह पर तैरनेवाला के 4 एमएल डीफ्रॉस्ट।
  2. दो 15 एमएल ट्यूब तैयार करें, प्रत्येक में 2 एमएल एच 6 सी 7 संस्कृति माध्यम है।
  3. पहली ट्यूब के लिए, प्रत्येक रीप्रोग्रामिंग लेंटवायरस (पीएसआईएन 4-सीएमवी-के 2 एम और पीएसआईएन 4-ईएफ 1 ए-ओ 2 एस) के 4 एमएल और 4.5 मिलीग्राम / एमएल पॉलीब्रेन (अंतिम 4.5 माइक्रोग्राम / एमएल) के 8 माइक्रोन जोड़ें और मिश्रण करें।
  4. दूसरी ट्यूब में, 4.5 मिलीग्राम/एमएल पॉलीब्रेन (अंतिम 4.5 माइक्रोग्राम/एमएल) के 2 माइक्रोन जोड़ें।
  5. दोनों कुओं से माध्यम त्यागें और पीबीएस के साथ एक बार धो लें.
  6. पहले अच्छी तरह से reprogramming संक्रमण मीडिया (ट्यूब 1) जोड़ें.
  7. ट्यूब 2 के मिश्रण को दूसरे कुएं में डालें। यह असंक्रमित नियंत्रण होगा।
  8. संक्रमित H6C7 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस वायरस और 5% CO2 रात भर इनक्यूबेट करें।
  9. अगले दिन, दोपहर में, दोनों कुओं से मीडिया को त्यागें और उन्हें एक ताजा H6c7 संस्कृति माध्यम से बदलें।
  10. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 48 घंटे के लिए 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।

6. hFib कोशिकाओं का लेंटीवायरस पारगमन

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस वायरस इनक्यूबेटर में प्रत्येक लेंटवायरस सतह पर तैरनेवाला के 2 एमएल डीफ्रॉस्ट।
  2. दो 15 एमएल ट्यूब तैयार करें, प्रत्येक में 2 एमएल एचएफआईबी संस्कृति माध्यम हो।
  3. पहली ट्यूब के लिए, प्रत्येक रिप्रोग्रामिंग वायरस (pSIN4-CMV-K2M और pSIN4-EF1a-O2S) के 2 एमएल जोड़ें और 4.5 मिलीग्राम/एमएल पॉलीब्रेन (अंतिम 4.5 माइक्रोग्राम/एमएल) के 4 माइक्रोन जोड़ें और मिश्रण करें।
  4. दूसरी ट्यूब में, 4.5 मिलीग्राम/एमएल पॉलीब्रेन (अंतिम 4.5 माइक्रोग्राम/एमएल) के 2 माइक्रोन जोड़ें और मिश्रण करें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से से माध्यम त्यागें और पीबीएस के साथ एक बार धो लें.
  6. पहले अच्छी तरह से reprogramming संक्रमण मीडिया (ट्यूब 1) जोड़ें.
  7. ट्यूब 2 के मिश्रण को दूसरे कुएं में डालें। यह असंक्रमित नियंत्रण होगा।
  8. संक्रमित hFib कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 रात भर इनक्यूबेट करें।
  9. अगले दिन, दोपहर में, दोनों कुओं से मीडिया को त्यागें और इसे ताजा एचएफआईबी संस्कृति माध्यम के साथ बदलें।
  10. कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एक और 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: कुशल लेंटवायरस पारगमन के लिए, लेंटवायरस की मात्रा को ध्यान से टिटर करें, क्योंकि यह विभिन्न सेल प्रकारों के बीच बहुत भिन्न होता है। कुछ सेल प्रकारों के लिए कई लेंटवायरस ट्रांसडक्शन की आवश्यकता हो सकती है। PDAC सेल लाइनों को तीन खुराक तक की आवश्यकता होती है, जबकि एक खुराक BxPc3, H6C7 और hFib लाइनों को पुन: प्रोग्राम करने के लिए पर्याप्त थी।

7. आईएमईएफ फीडर कोशिकाओं की तैयारी

  1. पीबीएस के साथ 1% जिलेटिन स्टॉक समाधान को पतला करके 40 एमएल 0.2% जिलेटिन समाधान तैयार करें।
  2. 0.2% जिलेटिन समाधान के 2 एमएल के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से कवर करके चार 6-अच्छी प्लेटों को कोट करें।
  3. कम से कम 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर जिलेटिन-लेपित प्लेटों को इनक्यूबेट करें।
  4. अतिरिक्त जिलेटिन समाधान महाप्राण और प्लेटों प्रवाह हुड के नीचे सूखी करने के लिए छोड़ दें.
  5. विकिरणित माउस भ्रूण फाइब्रोब्लास्ट (आईएमईएफ) के दो शीशियों (~ 4 मिलियन कोशिकाओं प्रति शीशी) को 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में घुमाकर पिघलाएं।
    नोट: संदूषण की संभावना को कम करने के लिए, टोपी खोलने के पास पानी को छींटे मारने से रोकने के लिए सावधान रहें। शीशी को कागज़ के तौलिये से सुखाएं और इसे 70% इथेनॉल से स्प्रे करें।
  6. टिशू कल्चर हुड में, प्रत्येक पिघले हुए आईएमईएफ शीशी की सामग्री को एक 15 एमएल ट्यूब में पिपेट करें जिसमें ड्रॉपवाइज फैशन में प्री-वार्म्ड एचएफआईबी कल्चर माध्यम के 10 एमएल होते हैं और ट्यूब को धीरे से उलटकर अच्छी तरह मिलाते हैं।
  7. कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए 309 x ग्राम पर सेल निलंबन नीचे स्पिन और प्रत्येक ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला हटा दें। 12 एमएल एचएफआईबी माध्यम में प्रत्येक सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. जिलेटिन-लेपित 6-अच्छी तरह से प्लेटों के प्रति सेल निलंबन की प्लेट 2 एमएल। समान रूप से धीरे सभी दिशाओं में प्लेटों मिलाते हुए कोशिकाओं को वितरित.
  9. प्लेटों को रात भर 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: रिप्रोग्रामिंग प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने से पहले ताजा आईएमईएफ प्लेटें 24 घंटे तैयार करें।

8. संक्रमित कोशिकाओं को आईएमईएफ फीडर परत पर स्थानांतरित करना

  1. संक्रमित और गैर-संक्रमित PDAC, BxPc3, H6c7 और hFib कोशिकाओं से मीडिया को त्यागें। कमरे के तापमान पर पीबीएस के साथ दो बार प्रत्येक अच्छी तरह से धो लें.
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से ट्रिप्सिन के 0.5 एमएल जोड़कर प्लेट से कोशिकाओं को अलग करें। 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 5% ओ2 (हाइपोक्सिया) इनक्यूबेटर में पीडीएसी कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  3. 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर बीएक्सपीसी 3 कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  4. 4 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर एच 6 सी 7 और एचएफआईबी कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. प्रत्येक अच्छी तरह से से अलग सेल निलंबन को संक्रमित या असंक्रमित के रूप में तदनुसार लेबल किए गए 15 एमएल ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
  6. निम्नानुसार centrifugation द्वारा कोशिकाओं हार्वेस्ट: PDAC के लिए, 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर सेल निलंबन स्पिन; BxPc3 के लिए, 5 मिनट के लिए 120 x ग्राम पर सेल निलंबन स्पिन; H6C7 के लिए, सेल निलंबन को 4 मिनट के लिए 112 x ग्राम पर स्पिन करें; hFib के लिए, 3 मिनट के लिए 161 x ग्राम पर सेल निलंबन स्पिन. कमरे के तापमान पर सभी centrifugations प्रदर्शन.
  7. उपयुक्त संस्कृति मीडिया के 1 एमएल में प्रत्येक सेल प्रकार गोली को फिर से निलंबित करें।
  8. प्रत्येक सेल प्रकार संस्कृति मीडिया के साथ दो बार चरण 7 में तैयार आईएमईएफ प्लेटों को धोएं। यानी, पीडीएसी मीडिया के साथ एक प्लेट धोएं, एक बीएक्सपीसी 3 मीडिया के साथ, एक एच 6 सी 7 माध्यम के साथ, और दूसरा एचएफआईबी माध्यम के साथ।
  9. प्लेट 50,000 संक्रमित कोशिकाओं अच्छी तरह से आईएमईएफ 6 अच्छी तरह से थाली के पांच कुओं में. आईएमईएफ 6-वेल प्लेट के शेष एक कुएं में 50,000 असंक्रमित नियंत्रण कोशिकाओं को प्लेट करें।
    नोट: अच्छी तरह से प्रति 1,000 से 50,000 कोशिकाओं तक चढ़ाया जाने वाला संक्रमित कोशिकाओं की संख्या का अनुकूलन करें।
  10. रात भर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 5% ओ2 (हाइपोक्सिया) पर पीडीएसी कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  11. बीएक्सपीसी 3, एच 6 सी 7, और एचएफआईबी कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 रात भर इनक्यूबेट करें।
  12. अगले दिन, निम्नानुसार reprogramming माध्यम तैयार: 100 एमएल नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन (25% अंतिम), 200 मिमी glutamine (1 मिमी अंतिम) के 5 एमएल, 100x गैर आवश्यक अमीनो एसिड के 5 एमएल (100 माइक्रोन अंतिम), बीटा mercaptoethanol के 1.5 एमएल जोड़ें (0.1 मिमी अंतिम) 400 एमएल संशोधित ईगल मध्यम (डीएमईएम) के लिए.
  13. रिप्रोग्रामिंग मीडिया को 100 एमएल एलिकोट में 4 डिग्री सेल्सियस पर 4 सप्ताह तक या -20 डिग्री सेल्सियस पर लंबे समय तक स्टोर करें।
  14. उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, एक 100 एमएल रिप्रोग्रामिंग मीडिया एलिकोट में 10 मिलीग्राम/एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) (10 एनजी/एमएल फाइनल) के 100 माइक्रोन जोड़ें।
  15. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में reprogramming मीडिया गर्म.
  16. दो बार पूर्व गर्म reprogramming मीडिया के साथ iMEFs फीडर पर बढ़ कोशिकाओं को धो लें.
    प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए reprogramming माध्यम के 2 एमएल जोड़ें.
  17. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2और 3% ओ2 (हाइपोक्सिया) इनक्यूबेटर में रिप्रोग्रामिंग प्लेटों स्थानांतरण.
    नोट: जिस दिन रिप्रोग्रामिंग मीडिया जोड़ा जाता है उसे रीप्रोग्रामिंग का दिन 1 माना जाता है।
  18. ताजा reprogramming मीडिया के साथ दैनिक कोशिकाओं फ़ीड जब तक IPSC कालोनियों प्रकट करने के लिए शुरू.
    नोट: उनके ईएससी की तरह आकृति विज्ञान (अच्छी तरह से परिभाषित किनारों के साथ कॉम्पैक्ट कालोनियों और एक उच्च नाभिक / साइटोप्लाज्म अनुपात के साथ कोशिकाओं के शामिल) द्वारा आईपीएससी कालोनियों की पहचान.
  19. आईपीएससी कॉलोनियों की दैनिक निगरानी करें, और पर्याप्त संख्या में गठन के बाद, उन्हें एक पूल के रूप में पारित करें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि आईपीएससी कालोनियों एक दूसरे को छू नहीं है, इस भेदभाव में परिणाम और उनके दीर्घकालिक स्थिरता को प्रभावित करेगा के रूप में.
  20. क्लोनल लाइनों को स्थापित करने के लिए, आईपीएससी पूल को लगभग 5 बार पारित करें, फिर मजबूत कॉलोनियों को चुनें जो उनके ईएससी जैसी आकृति विज्ञान को बनाए रखते हैं।
  21. पूरी तरह से reprogrammed आईपीएससी कालोनियों की पहचान करने के लिए, टीआरए-160 ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ रहते धुंधला बाहर ले जाने, और जीन अभिव्यक्ति लक्षण वर्णन के लिए आईपीएससी कालोनियों से फसल आरएनए.

9. आईपीएससी कॉलोनियों का पासिंग

  1. चरण 7 में वर्णित IPSC कालोनियों को पारित करने से पहले पर्याप्त iMEF फीडर प्लेटें 24 घंटे तैयार करें।
  2. iMEF फीडर प्लेटों को प्री-वार्म किए गए रीप्रोग्रामिंग मीडिया से दो बार धोएं।
  3. आईएमईएफ प्लेट के प्रत्येक कुएं में रॉक अवरोधक (वाई 2) (10 माइक्रोन) के साथ पूरक रिप्रोग्रामिंग मीडिया के 2 एमएल जोड़ें।
  4. उपयोग के लिए तैयार होने तक आईएमईएफ प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 3% ओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  5. पीबीएस (0.5 एमएम फाइनल) में 0.5 एम ईडीटीए 1:1000 पतला करके एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड/फॉस्फेट बफर सलाइन (ईडीटीए/पीबीएस) घोल तैयार करें।
  6. प्रत्येक अच्छी तरह से ईडीटीए / पीबीएस के 0.5 एमएल के साथ रिप्रोग्रामिंग संस्कृति मीडिया को बदलें।
  7. सेल प्रकार के आधार पर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 3% ओ2 इनक्यूबेटर या कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें। BxPc3 और PDAC IPSC 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट इनक्यूबेशन की आवश्यकता है. H6C7 और hFib IPSC 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ऊष्मायन करने की जरूरत है.
  8. माइक्रोस्कोप के तहत IPSC कोशिकाओं की जाँच करें जब तक वे समान रूप से पूरे कॉलोनी भर में फीडर परत से अलग करने के लिए शुरू.
  9. एक 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में अलग IPSC सेल निलंबन लीजिए. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर नीचे स्पिन.
  10. वाई 2 (10 माइक्रोन) के साथ पूरक रिप्रोग्रामिंग मीडिया के 1 एमएल में सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  11. आईएमईएफ प्लेट के तीन कुओं में आईपीएससी सेल निलंबन के प्रत्येक 1 एमएल को स्थानांतरित करके आईएमईएफ फीडर परत पर कोशिकाओं को प्लेट करें।
    नोट: विभाजन अनुपात काटा आईपीएससी कालोनियों की संख्या के आधार पर भिन्न हो सकते हैं.
  12. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 और 3% ओ2 इनक्यूबेटर में सेते हैं।

10. TRA-1-60 के साथ IPSC कालोनियों के लाइव धुंधला हो जाना

  1. रिप्रोग्रामिंग मीडिया में 4 माइक्रोग्राम/एमएल टीआरए-1-60 एंटीबॉडी के प्रति कुएं 0.5 एमएल तैयार करें।
  2. रिप्रोग्रामिंग मीडिया को त्यागें और इसे प्रत्येक कुएं में 0.5 एमएल एंटीबॉडी मिश्रण के साथ बदलें। 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2, और 3% ओ2 इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट करें।
  3. कोशिकाओं को दो बार रिप्रोग्रामिंग मीडिया से धोएं।
  4. GFP फिल्टर का उपयोग कर एक सेल इमेजिंग प्रणाली के साथ प्रतिदीप्ति छवियों पर कब्जा.
  5. नकारात्मक नियंत्रण चैनल पर विचार करके छवि गुणवत्ता की जाँच करें।

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Representative Results

पीडीएसी, बीएक्सपीसी 3, एच 6 सी 7, और एचएफआईबी कोशिकाओं से प्राप्त आईपीएससी कालोनियों की आकृति विज्ञान प्रदर्शित करने वाले प्रतिनिधि चित्र चित्र 1में दिखाए गए हैं। PDAC-IPSC कालोनियों reprogramming के दिन 25 पर फार्म करने के लिए शुरू किया. एक अधिक स्थापित ईएससी की तरह आकृति विज्ञान के साथ मजबूत आईपीएससी कालोनियों reprogramming (चित्रा 1) के दिन 40 पर पहचान की गई. इसी तरह, BxPc3-IPSC का गठन 23 वें दिन शुरू हुआ और दिन 35 तक अधिक स्थापित हो गया। H6C7-IPSC गठन PDAC-IPSC के समान था और दिन 45 पर स्थापित होना शुरू हुआ। hFib-IPSC कालोनियों reprogramming के दिन 15 पर फार्म करने के लिए शुरू किया.

Figure 1
चित्रा 1: आईपीएससी कालोनियों के प्रतिनिधि छवियों. छवियों में (ए) पीडीएसी, (बी) बीएक्सपीसी 3, (सी) एच 6 सी 7, और (डी) एचएफआईबी से प्राप्त एचईएससी जैसी आकृति विज्ञान की स्थापना की गई है। प्रत्येक छवि के ऊपर रिप्रोग्रामिंग के दिन इंगित किए गए हैं। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। 

क्लोनल IPSC लाइनों PDAC, BxPc3, H6C7, और hFib कोशिकाओं के प्रत्येक reprogramming से स्थापित किए गए थे. सभी स्थापित आईपीएससी लाइनों ने टीआरए-1-60 के लिए सकारात्मक दाग दिया, एक उदासीन एचईएससी सेल सतह मार्कर, प्लुरिपोटेंसी(चित्रा 2)के लिए उनके रिप्रोग्रामिंग की पुष्टि की।

Figure 2
चित्रा 2: क्लोनल आईपीएससी लाइनों की प्रतिनिधि छवियां। छवियों को (ए) पीडीएसी, (बी) बीएक्सपीसी 3, (सी) एच 6 सी 7, और (डी) एचएफआईबी से लिया गया है जो ईएससी जैसी आकृति विज्ञान (शीर्ष पैनल) और टीआरए -1-60 (नीचे पैनल) के लिए सकारात्मक धुंधला दिखा रहा है। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

कैंसर प्रगति का अध्ययन करने के लिए IPSC reprogramming के उपयोग की सुविधा के लिए, एक मजबूत प्रोटोकॉल अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं reprogramming के लिए स्थापित किया गया है. प्लुरिपोटेंसी में कैंसर कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग करना अब तक बहुत चुनौतीपूर्ण साबित हुआ है, क्योंकि केवल कुछ अध्ययनों ने कैंसर कोशिकाओं 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46 से आईपीएससी को सफलतापूर्वक उत्पन्न किया है. इन अध्ययनों में से अधिकांश आईपीएससी लाइनों उत्पन्न करने के लिए अमर कैंसर सेल लाइनों का इस्तेमाल किया, नहीं प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं 36,37,38,40,42,43,44,46. उदाहरण के लिए, चार अलग अलग जिगर कैंसर सेल लाइनों reprogramming OSKM कारकों के retroviral परिचय का उपयोग करने का प्रयास किया गया था, लेकिन केवल एक ही सेल लाइन सफलतापूर्वक41 reprogrammed किया गया था. हालांकि, उत्पन्न यकृत कैंसर आईपीएससी लाइन ने कुछ मार्ग के बाद स्टेमनेस का नुकसान दिखाया, ओएसकेएम रिप्रोग्रामिंग41 के लिए कैंसर कोशिकाओं के उच्च प्रतिरोध को उजागर किया। पहले, व्यक्तिगत रूप से ओएसकेएम के लेंटिवायरल डिलीवरी का उपयोग करके पीडीएसी कोशिकाओं को पुन: प्रोग्राम करने का प्रयास किया गया था; हालांकि, केवल एक एकल आईपीएससी लाइन उत्पन्न किया गया था, बहिर्जात ओसकेएम अभिव्यक्ति पर निर्भर और इसलिए पूरी तरह से37 reprogrammed नहीं. एक अन्य अध्ययन ने जीनोमिक एकीकरण के बिना ओसकेएम कारकों को वितरित करने के लिए एपिसोमल वैक्टर का उपयोग किया, लेकिन केवल पीडीएसी39 से एक एकल आईपीएससी क्लोन उत्पन्न करने में कामयाब रहे। कैंसर कोशिकाओं reprogramming में सीमित सफलता कई चुनौतियों कैंसर अनुसंधान में IPSC प्रौद्योगिकी के उपयोग में बाधा को कहते हैं.

यहाँ, प्राथमिक PDAC नमूनों से IPSC की पीढ़ी दो अलग अलग रोगियों और एक स्थापित PDAC सेल लाइन (BxPc3) से व्युत्पन्न समझाया गया है. इसके अलावा, IPSC भी H6c7 से उत्पन्न किया गया है, एक अग्नाशयी डक्टल उपकला सेल लाइन. हमारे ज्ञान के लिए, यह सफलतापूर्वक BxPc3 और H6c7 से व्युत्पन्न स्थिर IPSC लाइनों की पहली रिपोर्ट है. इस प्रोटोकॉल के बाद, आईपीएससी को स्वस्थ व्यक्तियों से प्राप्त प्राथमिक मानव फाइब्रोब्लास्ट से भी सफलतापूर्वक उत्पन्न किया गया है, जो कैंसर अनुसंधान से परे विधि की प्रयोज्यता का विस्तार करता है।

प्रोटोकॉल की सफलता के पीछे प्रमुख तत्वों में से एक ओएस और केएम कारकों को सह-व्यक्त करने के लिए बाइसिस्ट्रोनिक लेंटिवायरल वैक्टर का उपयोग है। इन सदिशों में आंतरिक राइबोसोम प्रविष्टि स्थल 2 (IRES2) होता है जो एक सदिश में OCT4 और SOX2 और दूसरे में KLF4 और cMYC को व्यक्त करता है। मोनोसिस्ट्रोनिक वैक्टर का उपयोग करते हुए कई अध्ययनों से पता चला है कि प्रत्येक वेक्टर का तेज अलग है, ओएसकेएम स्टोइकोमेट्री और रिप्रोग्रामिंग दक्षता47 को प्रभावित करता है। बाइसिस्ट्रोनिक वैक्टर का उपयोग करने से इस समस्या को कम करने में मदद मिल सकती है। इसके अलावा, लेंटिवायरल वैक्टर में आईआरईएस का उपयोग रिप्रोग्रामिंग दक्षता48 में उल्लेखनीय वृद्धि से पता चला है. इस लेंटवायरस सिस्टम में, OS एक्सप्रेशन EF1a प्रमोटर द्वारा संचालित होता है, जबकि KM एक्सप्रेशन CMV प्रमोटर के नियंत्रण में होता है। यह ज्ञात है कि सीएमवी प्रमोटर को ईएफ 1 ए49,50 के विपरीत, डीएनए मेथिलिकरण और हिस्टोन डेसिटिलेशन द्वारा अत्यधिक कुशल चुप्पी के अधीन किया जा सकता है। इसलिए, रीप्रोग्रामिंग के दौरान ओएस से पहले केएम की प्रारंभिक चुप्पी प्रोटोकॉल की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कारक हो सकती है। यह पिछले अध्ययनों के अनुरूप है जो 51,52,53,54,55 रिप्रोग्रामिंग के दौरान ओसकेएम अभिव्यक्ति गतिशीलता के महत्व को दर्शाता है। इस प्रकार, बाइसिस्ट्रोनिक वेक्टर पॉलीसिस्ट्रोनिक वेक्टर की तुलना में भी अधिक फायदेमंद है, जहां सभी ओएसकेएम कारक एकल प्रमोटर56 से व्यक्त किए जाते हैं। प्रोटोकॉल की सफलता में योगदान देने वाले अन्य कारकों में लेंटवायरस संक्रमण की खुराक और रीप्रोग्रामिंग के लिए उपयोग की जाने वाली संक्रमित कोशिकाओं की संख्या शामिल है, जिन्हें प्रत्येक सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया गया था।

सारांश में, अन्य सेल लाइनों और सामान्य कोशिकाओं के साथ प्राथमिक पीडीएसी कोशिकाओं को पुन: प्रोग्रामिंग करने के लिए एक अनुकूलित विधि प्रस्तुत की गई है। यह विधि कैंसर की प्रगति को मॉडल करने के लिए आईपीएससी रीप्रोग्रामिंग के उपयोग का विस्तार करने में मदद करेगी और इस मामले में, प्रारंभिक पीडीएसी बायोमार्कर की खोज करेगी।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

एएस और जेके वित्त पोषण के लिए कैंसर रिसर्च यूके और ओएचएसयू को धन्यवाद देना चाहते हैं (सीआरयूके-ओएचएसयू प्रोजेक्ट अवार्ड C65925/A26986)। एएस एक एमआरसी कैरियर विकास पुरस्कार (एमआर / N024028/1) द्वारा समर्थित है। एए को विज्ञान और प्रौद्योगिकी के लिए किंग अब्दुलअजीज सिटी से पीएचडी छात्रवृत्ति (छात्रवृत्ति संदर्भ 1078107040) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। जेके को एमआरएफ न्यू इन्वेस्टिगेटर ग्रांट (GCNCR1042A) और नाइट सीडर ग्रांट (68182-933-000, 68182-939-000) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। हम प्रोफेसर कीसुके काजी को कृपया रीप्रोग्रामिंग वेक्टर pSIN4-EF1a-O2S और pSIN4-CMV-K2M प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। खुली पहुंच के उद्देश्य से, लेखक ने इस सबमिशन से उत्पन्न होने वाले किसी भी लेखक स्वीकृत पांडुलिपि संस्करण के लिए क्रिएटिव कॉमन्स एट्रिब्यूशन (सीसी बाय) लाइसेंस लागू किया है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Mercaptoethanol (50 mM) Thermo Fisher 31350010
Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R BioLegend 330613
Bovine Pituitary Extract (BPE) Thermo Fisher 13028014
BxPc3 ATCC CRL-1687
Cholera Toxin from Vibrio cholerae Merck  C8052-1MG
Collagen, Type I solution from rat tail Merck  C3867
Completed Defined K-SFM Thermo Fisher  10744-019
Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates Merck  CLS3516
Corning syringe filters Merck  CLS431231
Corning tissue-culture treated culture dishes Merck  CLS430599
Day Impex Virkon Disinfectant Virucidal Tablets Thermo Fisher 12328667
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) Merck  D8537
Fetal Calf Serum (FCS)  Thermo Fisher 10270-106
Fugene HD Transfection Reagent  Promega   E2312
Gelatin solution, Type B, 2% in H2O Merck  G1393-100ML
Glasgow Minimum Essential Media (GMEM) Merck  G5154
Human EGF Recombinant Protein Thermo Fisher PHG0311
Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech Thermo Fisher 100-18B
Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7) Kerafast ECA001-FP
iMEF feeder cells  iXcells Biotechnologies 10MU-001-1V
Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)  Thermo Fisher 17005-042
KnockOut DMEM  Thermo Fisher 10829018
KnockOut serum Replacement  Thermo Fisher 10828028
L-Glutamine (200 mM) Thermo Fisher 25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) Thermo Fisher 11140050
Millex-HP 0.45 μM syringe Filter Unit (Sterile) Merck  SLHP033RS
Opti-MEM Reduced Serum Medium  Thermo Fisher 31985062
pMDG  AddGene 187440
Polybrene (Hexadimethrine bromide)  Merck  H9268-5G
pSIN4-CMV-K2M  AddGene 21164
pSIN4-EF2-O2S  AddGene 21162
psPAX2 AddGene 12260
pWPT-GFP  AddGene 12255
RPMI 1640 Medium (ATCC modification) Thermo Fisher A1049101
Sodym Pyruvate Thermo Fisher 11360-039
Sterile Syringes for Single Use (60 mL)  Thermo Fisher 15899152
TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red Thermo Fisher 12605036
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher 15575020
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies 72304

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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कैंसर अनुसंधान अंक 204
प्लुरिपोटेंसी के लिए अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा को पुन: प्रोग्रामिंग करना
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Alshaikh, A., Grygoryev, D., Keith,… More

Alshaikh, A., Grygoryev, D., Keith, D., Sheppard, B., Sears, R. C., Kim, J., Soufi, A. Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency. J. Vis. Exp. (204), e65811, doi:10.3791/65811 (2024).

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