פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של שלם<em> תסיסנית melanogaster</em> הזחלים. יש לנו ניצלו את הרדמה נדיפים desflurane כדי לאפשר הדמיה חוזרות ברזולוציה המשנה הסלולר מחדש זיהוי מבנים של עד כמה ימים<sup> 1</sup>.
שיפורים אחרונים הדמיה אופטית, fluorophores מקודדים גנטית וכלים הגנטי המאפשר הקמת יעיל של קווי הרצוי חיים מהונדס אפשרו תהליכים ביולוגיים להיחקר בהקשר של פרנסה, ובמקרים מסוימים אפילו מתנהג, האורגניזם. בפרוטוקול זה נתאר כיצד להרדים שלם הזחלים תסיסנית, באמצעות הרדמה נדיפים desflurane, לעקוב אחרי התפתחות של אוכלוסיות פלסטיות סינפטית על המשנה הסלולר ברזולוציה 1-3. בעוד שיטות שימושיים נוספים להרדים הזחלים תסיסנית melanogaster תוארו בעבר 4,5,6,7,8, פרוטוקול המוצגת כאן ממחישה שיפורים משמעותיים בשל התכונות הבאות מפתח משולב: (1) רמה גבוהה מאוד של הרדמה, אפילו פעימות הלב הוא נעצר המאפשר ברזולוציה ננומטר לרוחב של עד 150 1, (2) שיעור הישרדות גבוה של 90%> בכל מחזור הרדמה, המתירה הקלטה של יותר מחמש נקודות זמן על פני תקופה של שעות עד ימים 2 ו ( 3) רגישות גבוהה המאפשרת לנו 2 מקרים ללמוד את הדינמיקה של חלבונים לידי ביטוי ברמות פיזיולוגיות. בפירוט, היינו יכולים לחזות את קולטן הגלוטמט postsynaptic למקטע GluR-IIA לידי ביטוי באמצעות האמרגן אנדוגני 1 בקווים מהונדס יציבה קו מלכודת אקסון FasII-GFP 1. (4) בניגוד לשיטות אחרות 4,7 הזחלים ניתן הדמיה לא רק חי, אלא גם שלמות (כלומר לא גזור) המאפשר תצפית להתרחש על פני מספר ימים 1. הפרטים וידאו המלווה את הפונקציה של חלקים בודדים של in vivo הדמיה תא 2,3, הנכון הרכבה של הזחלים, הליך הרדמה, איך מחדש לזהות עמדות ספציפיות בתוך הזחל לבין הסרת בטוחה של הזחלים מן הדמיה קאמרית.
השיטה פותחה בתחילה הציג ללמוד סינפסות glutamatergic על הקיר שרירי הגוף של הזחלים melanogaster תסיסנית. Neuromuscular תסיסנית צומת (NMJ) מתאפיינת בארכיטקטורה Cyto-סטריאוטיפית של השרירים נוירונים ועל כן אידיאלי עבור הדמיה vivo. עם זאת, פרוטוקול הרדמה המתואר אינו מוגבל הדמיה NMJ; את השקיפות של הזחלים תסיסנית מאפשר עיבוד של פרוטוקול המתואר ללמוד על התפתחות איברים, הגירה של תאים, הובלת מטען axonal ותת הסלולר מחדש בתוך התאים.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים אנדריאס Schönle, מקס פלאנק, המכון לכימיה Biophysical, גרמניה דוד י סאנדסטרום, המכון הלאומי לבריאות הנפש, National Institutes of Health, Bethesda, MD, ארה"ב ייעוץ טכני. אנו מודים פרנק Kötting, אירופה Neuroscience Institute, גטינגן לבניית תא הדמיה המכשיר הרדמה. עבודה זו נתמכה על ידי תרומות של Forschung אלצהיימר היוזמה TMRYZ נתמך על ידי מענק של מלגות סין המועצה, SBH על ידי מענק של המדרשה עבור תאית ומולקולרית Neuroscience, מאוניברסיטת טובינגן.
Reagents:
Equipment: