Summary

Passieve Toediening van monoklonale antilichamen tegen H. capsulatum Ea schimmels

Published: February 14, 2011
doi:

Summary

C57BL / 6 muizen werden gebruikt om Hc pathogenese bestuderen en het beste model te bieden. We zijn het verkennen van de potentiële voordelen van humorale immuniteit tegen deze schimmel en genereerde verschillende mAb's [om histon H2B en een heat shock protein 60kDa] die we getest op hun beschermende werking na intraperitoneale toediening.

Abstract

Het doel van het gebruik van deze methodiek is 1) om onze capaciteit verder te gaan naar personen met een antilichaam of vaccin voor het voorkomen of behandelen histoplasmose veroorzaakt door de schimmel Histoplasma capsulatum en 2) de rol van virulentiefactoren te onderzoeken als doelwit voor de therapie te beschermen. Voor het genereren van mAb's, muizen geïmmuniseerd, worden de immuunreacties beoordeeld met behulp van een vaste fase ELISA-systeem ontwikkeld in ons laboratorium, en de beste responder muizen zijn geselecteerd voor het isoleren van splenocyten voor de fusie met hybridoma cellen. C57BL / 6 muizen zijn uitgebreid gebruikt om de H. studie capsulatum pathogenese en bieden het beste model voor het verkrijgen van de vereiste gegevens. Om de rol van de mAbs in infectie te beoordelen, muizen intraperitoneaal toegediend met mAb aan H. capsulatum of isotype gematchte controle mAb en vervolgens geïnfecteerd door een intraveneuze (iv), intraperitoneale (ip) of intranasaal (in) routes. In de wetenschappelijke literatuur, werkzaamheid van mAbs voor schimmelinfecties in muizen is gebaseerd op de sterfte als een eindpunt, in combinatie met kolonie formin eenheden (CFU) taxaties op eerdere tijdstippen. Overleving (tijd tot overlijden) studies zijn nodig omdat zij het best vertegenwoordigen menselijke ziekten. Zo zou doeltreffendheid van onze interventie niet afdoende worden vastgesteld zonder overlevingscurven. Dit geldt ook voor het vaststellen van de werkzaamheid van het vaccin of het testen van de mutanten voor de virulentie. Met histoplasmose, de muizen gaan vaak van die energieke om dode gedurende een aantal uren. De capaciteit van een interventie, zoals het toedienen van een mAb kan een dier in eerste instantie te beschermen tegen ziekte, maar de ziekte kan terugvallen, die niet zou worden gerealiseerd op korte CFU experimenten. In aanvulling op de overleving en schimmels last testen, onderzoeken we de inflammatoire respons op infectie (histologie, cellulair werving en selectie, cytokine responsen). Om te overleven / tijd om dood experimenten, zijn de muizen geïnfecteerd en gecontroleerd minstens tweemaal per dag op tekenen van ziekelijkheid. Voor de beoordeling van schimmel last, histopathologie, en cytokine respons, zijn de muizen gedood op verschillende tijdstippen na infectie. Dierproeven worden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Institute for Animal Studies van de Albert Einstein College of Medicine.

Protocol

1. Groei van H. Capsulatum Bereid een bioveiligheid kast voor het werken met de schimmel door het schoonmaken van de kast met 10% bleekmiddel, gevolgd door 20 minuten UV-straling. H. capsulatum in de gist fase vereist Biosafety level (BSL) II praktijken, terwijl de schimmel vorm vereist BSLIII. Gebruik van gist vorm in de volgende stappen. Volgende bereiden een 15 ml conische buis met 5 ml PBS. Oogst een kolonie van H. capsulatum (stam Hc ATCC G21…

Discussion

Het protocol hier gepresenteerde laat zien dat mAb's te H. capsulatum kunt de loop van de experimentele muizen histoplasmose. MAbs aan het celoppervlak antigenen van ziekteverwekkers kunt de complexe dynamiek die zich voordoen tijdens het samenspel tussen een host en een ziekteverwekker. Deze studie stelt vast dat mAbs bescherming in een muizenmodel van dodelijke histoplasmose bemiddelen bij het intraperitoneaal geïnjecteerd, en het suggereert de kandidaat-eiwitten voor de ontwikkeling van vaccins, zoals H…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Materials

Name of Material Company
Biological safety cabinet (BSL2)  
15 mL conical tubes Falcon, BD
HAM F-12 medium Gibco
37°C shaker  
Vortex  
50 mL conical tubes Falcon, BD
26G1/2 needle BD
10 mL syringe BD
250 mL flasks  
FPLC (Fast protein liquid chromatography) system GE Helthcare
ELISA reader BioTek
Anesthesia (ketamine and Xylazine)  
Column stands  
Nylon string  
Heat lamp  
70μm cell strainers Falcon, BD
BHI agar plates Gibco

Referenzen

  1. Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
  2. Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclonal antibodies to heat shock protein 60 alter the pathogenesis of Histoplasma capsulatum. Infect Immun 77. , 1357-1367 (2009).
  3. Guimaraes, A. J., Hamilton, A. J., de M Guedes, H. L., Nosanchuk, J. D., Zancope-Oliveira, R. M. Biological function and molecular mapping of M antigen in yeast phase of Histoplasma capsulatum. PLoS One. 3, e3449-e3449 (2008).
  4. Nosanchuk, J. D. Protective antibodies and endemic dimorphic fungi. Curr Mol Med. 5, 435-442 (2005).
  5. Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Jr, D. e. e. p. e., &amp, G. S., Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J Clin Invest. 112, 1164-1175 (2003).
  6. Nosanchuk, J. D., Steenbergen, J. N., Shi, L., Deepe, G. S., , ., Casadevall, A. Antibodies to a cell surface histone-like protein protect against Histoplasma capsulatum. J. Clin. Invest. 112, 1164-1175 (2003).
  7. Smith, W. Responses of laboratory animals to some injectable anaesthetics. Lab Anim. 27, 30-39 (1993).
check_url/de/2532?article_type=t

Play Video

Diesen Artikel zitieren
Guimarães, A. J., Martinez, L. R., Nosanchuk, J. D. Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens. J. Vis. Exp. (48), e2532, doi:10.3791/2532 (2011).

View Video