تشريح والتصوير من المناطق النشطة في ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي
Summary
الوصل العصبي العضلي (NMJ) من<em> ذبابة الفاكهة السوداء البطن</em> هو نظام نموذجا هاما لدراسة وظيفة متشابك العادي فضلا عن اضطرابات في وظيفة متشابك وجدت في بعض الأمراض العصبية. نقدم بروتوكول للتشريح<em> ذبابة الفاكهة</em> نظام المحرك اليرقات وimmunostaining عن البروتينات النشطة داخل منطقة NMJ.
Abstract
يرقات ذبابة الفاكهة الوصل العصبي العضلي (NMJ) هو نموذج ممتاز لدراسة بنية ووظيفة متشابك. ذبابة الفاكهة هو معروف جيدا لسهولة التلاعب الجيني قوية والنظام العصبي اليرقات وقد ثبت في دراسة مفيدة بشكل خاص ليس فقط وظيفة عادية ولكن أيضا اضطرابات التي تصاحب بعض الأمراض العصبية (لويد وتايلور ، 2010). وتوجد أيضا العديد من الجزيئات مفتاح متشابك وجدت في ذبابة الفاكهة في الثدييات ومثل معظم نقاط الاشتباك العصبي CNS مثير في الثدييات ، وذبابة الفاكهة وNMJ glutamatergic ويوضح نشاط تعتمد على إعادة عرض (كوه وآخرون ، 2000). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أن الخلايا العصبية تكون ذبابة الفاكهة التي تم تحديدها بشكل فردي بسبب أنماط تعصيب هم النمطية والتكرار مما يجعل من الممكن لدراسة محطات متشابك المحددة ، مثل تلك التي بين الخلايا العصبية الحركية والألياف العضلية الجسم الجدار أنهم يعصب (Keshishian وكيم ، 2004). وجود مكونات المشبك الحفاظ تطويريا مع سهولة التلاعب الجيني والجسدي جعل النموذج المثالي لذبابة الفاكهة التحقيق في الآليات الكامنة وراء وظيفة متشابك (Budnik ، 1996).
المناطق النشطة في محطات متشابك ذات أهمية خاصة لأن هذه هي مواقع لإطلاق العصبي. NC82 هو ريتوكسيماب تعترف البروتين ذبابة الفاكهة Bruchpilot (BRP) ، أحد أفراد العائلة CAST1/ERC التي هي عنصر مهم من منطقة نشطة (Wagh وآخرون ، 2006). وقد تبين لBRP شكل مباشر على منطقة نشطة تي بار ، وهي مسؤولة عن تجميع فعال كا 2 +. قنوات تحت كثافة تي بار (فوكيه وآخرون ، 2009) قللت من المسوخ BRP كا 2 + قناة كثافة ، والاكتئاب أثار إطلاق سراح الحويصلة ، واختلال في الأجل القصير اللدونة (Kittel وآخرون ، 2006). وقد لوحظت تغييرات على المناطق النشطة في نماذج مرض ذبابة الفاكهة. على سبيل المثال ، أظهرت المناعي باستخدام الأجسام المضادة التي تم NC82 انخفضت كثافة المنطقة النشطة في نماذج من التصلب الجانبي الضموري وبيت هوبكنز متلازمة (Ratnaparkhi وآخرون ، 2008 ؛. Zweier وآخرون ، 2009). وبالتالي ، قد تقييم المناطق النشطة ، أو البروتينات متشابك أخرى ، يرقات ذبابة الفاكهة في نماذج من الأمراض تقديم فكرة قيمة الأولية إلى وجود خلل متشابك.
يستعد كامل يرقات ذبابة الفاكهة يشن تشريح للتحليل المناعي للNMJ يتطلب بعض المهارة ، ولكن يمكن تحقيقه من قبل معظم العلماء مع القليل من الممارسة. قدم هو الأسلوب الذي ينص على أن تكون يرقات العديد من تشريح وimmunostained في طبق تشريح نفسه ، مما يحد من الاختلافات البيئية بين التركيب الوراثي وتوفير كل الحيوانات ما يكفي للثقة في استنساخ والتحليل الإحصائي.
Protocol
Discussion
عن الخلايا العصبية ، ومنطقة محطة متشابك هو أمر بالغ الأهمية ، وجسر للتواصل السليم بين آخر وخلايا ما قبل متشابك. وسيلة قوية للتحقق من صحة الخلايا العصبية في نماذج المرض هو تحليل البروتينات من محطة متشابك بواسطة المناعي. الأسلوب المناعي المعروضة هنا تمكن الباحث لدراسة…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور نائل العلمي والدكتور كيم نام تشول على تعليقاتهم المفيدة حول هذا المخطوط.
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Base | Dow Corning | 68037-59-2 | After mixing allow for bubbles to rise slowly out by putting on slow rotator or allowing to sit for 30 minutes or more. |
| Stainless Steel Minutien PIns | Fine Science Tools | 26002-10 | Trim to approx. 3-4mm in length with regular scissors |
| Laminectomy Forceps (Blunt- Used for grasping pins) | Fine Science tools | 11223-20 | Use as blunt forceps for grasping pins |
| Dissection Forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| SuperFine Vannas Scissors, 8cm long | World Precision Instruments | 501778 | |
| Mouse anti-Brp antibody | DSHB | NC82 | Use 1:50 dilution |
| Cy3 Affinipure Goat Anti-Horseradish Peroxidase | Jackson Immunoresearch | 123-165-021 | Use at 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 488 Goat anti-Mouse IgG | Invitrogen | A11001 | Use approx. 1:200 dilution |
Referenzen
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Maturation of active zone assembly by Drosophila Bruchpilot. J Cell Biol. 186, 129-145 (2009).
- Hoang, B., Chiba, A. Single-Cell Analysis of Drosophila Larval Neuromuscular Synapses. Entwicklungsbiologie. 229, 55-70 (2001).
- Keshishian, H., Kim, Y. -. S. Orchestrating development and function: retrograde BMP signaling in the Drosophila nervous system. Trends in Neurosciences. 27, 143-147 (2004).
- Kittel, R. J., Wichmann, C., Rasse, T. M., Fouquet, W., Schmidt, M., Schmid, A., Wagh, D. A., Pawlu, C., Kellner, R. R., Willig, K. I., Hell, S. W., Buchner, E., Heckmann, M., Sigrist, S. J. Bruchpilot Promotes Active Zone Assembly, Ca2+ Channel Clustering, and Vesicle Release. Science. 312, 1051-1054 (2006).
- Koh, Y. H., Gramates, L. S., Budnik, V. Drosophila larval neuromuscular junction: Molecular components and mechanisms underlying synaptic plasticity. Microscopy Research and Technique. 49, 14-25 (2000).
- Lloyd, T. E., Taylor, J. P. Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease. Ann N Y Acad Sci. 1184, e1-e20 (2010).
- Ratnaparkhi, A., Lawless, G. M., Schweizer, F. E., Golshani, P., Jackson, G. R. A Drosophila model of ALS: human ALS-associated mutation in VAP33A suggests a dominant negative mechanism. PLoS One. 3, e2334-e2334 (2008).
- Wagh, D. A., Rasse, T. M., Asan, E., Hofbauer, A., Schwenkert, I., Dürrbeck, H., Buchner, S., Dabauvalle, M. -. C., Schmidt, M., Qin, G., Wichmann, C., Kittel, R., Sigrist, S. J., Buchner, E. Bruchpilot, a Protein with Homology to ELKS/CAST, Is Required for Structural Integrity and Function of Synaptic Active Zones in Drosophila. Neuron. 49, 833-844 (2006).
- Zweier, C., Jong, E. K. d. e., Zweier, M., Orrico, A., Ousager, L. B., Collins, A. L., Bijlsma, E. K., Oortveld, M. A., Ekici, A. B., Reis, A., Schenck, A., Rauch, A. CNTNAP2 and NRXN1 are mutated in autosomal-recessive Pitt-Hopkins-like mental retardation and determine the level of a common synaptic protein in Drosophila. Am J Hum Genet. 85, 655-666 (2009).
