Dissection und Imaging von aktiven Zonen in der Drosophila Neuromuskulären Synapse

Zusammenfassung

Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) von Drosophila melanogaster Ist ein wichtiges Modellsystem für die Untersuchung normale synaptische Funktion sowie Störungen der synaptischen Funktion in bestimmten neurologischen Erkrankungen gefunden. Wir präsentieren ein Protokoll für die Präparation des Drosophila Larven motorischen System und Immunfärbung für aktive Zone Proteine ​​innerhalb der NMJ.

Zusammenfassung

Die Drosophila-Larven neuromuskulären Synapse (NMJ) ist ein ausgezeichnetes Modell für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktion. Drosophila ist bekannt für die Leichtigkeit des starken genetischen Manipulationen und die Larven des Nervensystems hat sich besonders bewährt bei der Untersuchung nicht nur die normale Funktion, sondern auch Störungen bekannt daß begleiten einige neurologische Erkrankung (Lloyd und Taylor, 2010). Viele wichtige synaptische Moleküle in Drosophila gefunden werden auch in Säugetieren gefunden und wie die meisten ZNS-Synapsen in Säugetieren ist das Drosophila NMJ glutamatergen und zeigt Aktivität abhängig Umbau (Koh et al., 2000). Darüber hinaus können Drosophila Neuronen werden individuell identifiziert, weil ihre Innervation Muster stereotype und repetitive machen es möglich, identifiziert synaptischen Terminals, wie sie zwischen Motoneuronen und der Körper-Wand Muskelfasern, die sie innervieren (Keshishian und Kim, 2004). Studie Die Existenz der evolutionär konserviert Synapse Komponenten zusammen mit der Leichtigkeit von genetischen und physikalische Manipulation machen die Drosophila-Modell ideal für die Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen synaptischer Funktion (Budnik, 1996).

Die aktiven Zonen am synaptischen Terminals sind von besonderem Interesse, da diese die Standorte der Freisetzung von Neurotransmittern sind. NC82 ist ein monoklonaler Antikörper, der Drosophila-Protein Bruchpilot (BRP), ein CAST1/ERC Familienmitglied, das ein wichtiger Bestandteil der aktiven Zone (Wagh et al., 2006) wird anerkannt. Brp wurde gezeigt, direkten Einfluss auf die aktive Zone T-bar und ist verantwortlich für die effektive Bündelung Ca ^{2 +-Kanäle} unter dem T-Bar-Dichte (Fouquet et al., 2009). Mutanten von BRP haben Ca ^{2 +} reduziert Kanaldichte, deprimiert evozierte Vesikelfreisetzung und veränderte kurzfristige Plastizität (Kittel et al., 2006). Änderungen an aktiven Zonen in Drosophila Krankheitsmodelle beobachtet worden. Zum Beispiel zeigten Immunfluoreszenz mit dem NC82-Antikörper, der die aktive Zone Dichte in Modellen von amyotrophe Lateralsklerose und Pitt-Hopkins-Syndrom (Ratnaparkhi et al, 2008.; Zweier et al, 2009.) Verringert wurde. So kann die Evaluierung von aktiven Zonen oder anderen synaptischen Proteinen, in Drosophila-Larven Modelle von Krankheiten stellen eine wertvolle erste Hinweise auf die Anwesenheit eines synaptischen Defekt.

Vorbereiten ganzen Berg seziert Drosophila-Larven für Immunfluoreszenz Analyse der NMJ erfordert etwas Geschick, kann aber von den meisten Wissenschaftlern mit ein wenig Übung erreicht werden. Präsentiert wird eine Methode, die für mehrere Larven präpariert und immungefärbt in der gleichen Präparation Gericht stellt, Begrenzung der Umwelt-Unterschiede zwischen den einzelnen Genotyp und bietet genügend Tiere für das Vertrauen in die Reproduzierbarkeit und statistische Analyse.

Protokoll

1. Vorbereitung für Immunfluoreszenz:

1. So erstellen Sie ein Sezieren Oberfläche, pour Sylgard 184 Silikon-Elastomer Basis in einen kleinen Gewebekulturplatte. Achten Sie darauf, nicht auf die Platte komplett, so dass die Dissektion Bereich niedriger als der Rand zu füllen.
2. Trim Dissektion Stifte zu einer Länge von ca. 3,5 mm für eine einfachere Handhabung, und stellen Sie sicher, mindestens 6 Pins pro Larve haben.
3. Sie müssen stumpfen Pinzette, mit denen Sie erfassen die Stifte für die Dissektion wird.

2. Dissection der Larven:

1. Wählen Sie wandern dritten Larvenstadium, die sich um die Seiten d....

Diskussion

Für Neuronen wird die synaptische Anschlussbereich von entscheidender Bedeutung, und ist die Brücke für eine ordnungsgemäße Kommunikation zwischen dem post-und pre-synaptischen Zellen. Ein guter Weg, um die Gesundheit des Neurons in Krankheitsmodelle zu untersuchen ist, Proteine ​​der synaptischen Terminals durch Immunfluoreszenz analysiert. Die Immunfluoreszenz hier vorgestellte Methode ermöglicht es dem Forscher, viele Larven gleichzeitig zu untersuchen, während die Begrenzung der ökologischen Unterschiede zwischen de.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenz	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Sylgard 184 Silikon-Elastomer Basis	Dow Corning	68037-59-2	Nach dem Mischen ermöglichen Blasen steigen langsam aus, indem Sie auf langsamen Rotor oder die Möglichkeit für 30 Minuten oder mehr sitzen.
Stainless Steel Minutien Pins	Feine Science Tools	26002-10	Trim auf ca.. 3-4mm lang mit regelmäßigen Schere
Laminektomie Pinzetten (zum Greifen Pins Blunt-Used)	Feine Werkzeuge Wissenschaft	11223-20	Verwenden Sie als einer stumpfen Zange zum Greifen Pins
Dissektionszangen	World Precision Instruments	501985
SuperFine Vannas Schere, 8cm lang	World Precision Instruments	501778
Maus anti-Brp Antikörper	DSHB	NC82	Verwenden 1:50-Verdünnung
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Meerrettichperoxidase	Jackson Immunoresearch	123-165-021	Verwenden Sie bei 1:200-Verdünnung
Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG	Invitrogen	A11001	Verwenden Sie ca.. 1:200-Verdünnung