Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

Zusammenfassung

Eine vereinfachte, aber genaue Methode zu sammeln und zu färben Mücke Blutzellen beschrieben. Unsere Methode kombiniert die Einfachheit der Perfusion mit der Genauigkeit der hohe Einspritzdruck Techniken zur sauberen Vorbereitung der Blutzellen in Aedes Moskitos zu isolieren. Diese Methode erleichtert Studien erfordern Kenntnisse über die Arten von Blutzellen und deren Hülle und Fülle.

Zusammenfassung

Moskitos sind Vektoren für eine Reihe von Krankheitserregern wie das Gelbfieber-Virus, Malaria Parasiten und Filarien. Laboratories untersuchen anti-Erreger Bestandteile des angeborenen Immunsystems in Krankheitsüberträgern Arten in der Hoffnung, von transgenen Mücken, die refraktär gegenüber solchen Pathogenen ^{1, 2} sind. Das angeborene Immunsystem der Moskitos besteht aus mehreren Zeilen Defense ^3. Erreger, die die Barriere durch das Epithel ausgekleideten Moskito Mitteldarm ⁴ verhängten entkommen geben Sie die Hämolymphe und Begegnung zirkulierenden Blutzellen, wichtige zelluläre Komponenten kapseln und zu verschlingen Krankheitserreger ^{5, 6.} Forscher haben keine Beweise für hämatopoetische Gewebe in Mücken gefunden und aktuelle Hinweise darauf, dass die Anzahl der Blutzellen bei Erwachsenen Entstehung ist fest und Zahlen können tatsächlich als die Mücke im Alter von ⁷ zurück. Die Fähigkeit, richtig zu sammeln und zu identifizieren Blutzellen von medizinisch wichtigen Insekten ist ein wesentlicher Schritt für das Studium der zellulären Immunität. Allerdings stellen die geringe Größe der Mücken und der begrenzten Volumen von Hämolymphe eine Herausforderung für das Sammeln Immunzellen.

Zwei etablierte Methoden für die Erfassung Mücke Blutzellen gehören Vertreibung der Hämolymphe von einem Schnitt Rüssel ^8, und das Volumen Verschiebung (Perfusion), in der Salzlösung in die membranöse necklike Region zwischen dem Kopf und Thorax (dh, Gebärmutterhals) und der perfundierten Hämolymphe gesammelt injiziert aus einem zerrissenen Öffnung in einem distalen Bereich des Bauches ^{9, 10.} Diese Techniken sind jedoch durch eine geringe Erholung der Blutzellen und mögliche Verunreinigungen durch Fett Körperzellen bzw. ¹¹ begrenzt. In jüngerer Zeit eine Methode bezeichnet als hohe Einspritzdruck / Recovery verbesserte Rückgewinnung von Immunzellen durch die Verwendung von gerinnungshemmenden Puffer bei gleichzeitiger Reduzierung Ebenen kontaminierender Skalen und inneren Geweben ^11. Während diese Methode ermöglicht ein verbessertes Verfahren zur Sammlung und Aufbewahrung Blutzellen für Primär-Kultur, bringt es eine Reihe von Einspritzung und Sammeln Schritte, die nicht notwendig sind, wenn der nachgeschaltete Ziel ist es, zu sammeln, zu fixieren und färben Blutzellen für die Diagnostik. Hier zeigen wir unsere Methode der Erhebung Moskito Hämolymphe, dass die Einfachheit der Durchblutung kombiniert mit gerinnungshemmenden Pufferlösungen anstelle von Kochsalzlösung, mit der Genauigkeit der hohe Einspritzdruck Techniken zur sauberen Vorbereitung der Blutzellen in Aedes Moskitos zu isolieren.

Protokoll

1. Vorbereitung im Vorfeld der hemocyte Sammlung

1. Bereiten Sie eine Hämolymphe Verdünnungsmittel Lösung, die von 60% Schneider-Medium, 10% fötalem Rinderserum (FBS), und 30% Citratpuffer besteht (Antikoagulans, 98 mM NaOH, 186 mM NaCl, 1,7 mM EDTA, 41 mM Zitronensäure, pH 4,5) ^11. Machen Sie 1,0 ml Aliquots, die bei -20 ° C gelagert werden können Verwenden Sie jedes Aliquot nur einmal (siehe Materialien).
2. Bereiten Objektträger aus Glas (75 x 25 x 1 mm) durch Scoring ein 1 cm Durchmesser-Kreis an einem Ende mit einem Glas-Ätz-Tool. Alternativ können Objektträger mit zwei vorgeätzt Kreisen erworben (z. B. Fisher Scientific oder EMS Quelle....

Diskussion

Die hemocyte Sammlung hier beschriebene Methode ist aus bisher publizierten Methoden modifiziert und erlaubt es, saubere Vorbereitung der Blutzellen von Aedes Moskitos mit weniger Schritten zu isolieren. Während unser besonderes Interesse liegt in der Charakterisierung hemocyte Populationen in Aedes Mücken, glauben wir, diese Technik auf andere Mücke Gruppen angewendet werden kann, nachdem erste Versuche durchgeführt werden, um eine ordnungsgemäße Injektionsvolumina zu bestimmen. Unser Protokoll verwen.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
Schneider-Medium	Sigma-Aldrich	S0146
Rinderfötenserum	Sigma-Aldrich	F0643
Hema3 Fleck-Kit	Fischer	123-869
Glasnadeln (Borosilikatglas mit Filament)	Sutter Instrument	BF100-78 bis 10	1,0 OD und 0.78mm ID
Needle Puller	Sutter Instruments	Modell P-87
Mikroinjektor	Tritech Forschung	Minj-PD
Nadelhalter	Tritech Forschung	Minj-4