Les efforts déployés pour isoler la sous-unité catalytique de la télomérase, TERT, en quantité suffisante pour des études structurales, ont été atteints avec un succès limité pendant plus d'une décennie. Ici, nous présentons les méthodes pour l'isolement de la protéine recombinante TERT Tribolium castaneum (<em> Tc</em> TERT) et la reconstitution de la population active<em> T. castaneum</emRibonucléoprotéine télomérase> (RNP) complexes<em> In vitro</em>.
Les efforts déployés pour isoler la sous-unité catalytique de la télomérase, TERT, en quantité suffisante pour des études structurales, ont été atteints avec un succès limité pendant plus d'une décennie. Ici, nous présentons les méthodes pour l'isolement de la protéine recombinante TERT Tribolium castaneum (Tc TERT) et la reconstitution de la T. actifs télomérase castaneum ribonucléoprotéines (RNP) complexes in vitro.
La télomérase est une transcriptase inverse spécialisée qui ajoute une répétition courts d'ADN, appelées télomères, à l'extrémité 3 'des chromosomes linéaires 2 qui servent à les protéger de bout en bout de fusion et de dégradation. Après réplication de l'ADN, un court segment est perdu à l'extrémité du chromosome 3, et sans télomérase, les cellules continuent divisant jusqu'à ce que finalement atteint leur limite de Hayflick 4. De plus, la télomérase est en dormance dans la plupart des cellules somatiques 5 chez les adultes, mais elle est active dans six cellules cancéreuses où il favorise l'immortalité cellulaire 7.
L'enzyme télomérase minimale se compose de deux éléments fondamentaux: la sous-unité protéique (TERT), qui comprend la sous-unité catalytique de l'enzyme et une composante intégrante ARN (TER), qui contient la TERT modèle utilise pour synthétiser les télomères 8,9. Avant 2008, seules les structures pour les domaines télomérase individu avait été résolu 10,11. Une percée majeure dans ce domaine est venu de la détermination de la structure cristalline des 12 actifs, sous-unité catalytique de T. télomérase castaneum, Tc TERT 1.
Ici, nous présentons les méthodes pour produire de grandes quantités de l'actif, Tc TERT solubles pour des études structurales et biochimiques, et la reconstitution du complexe RNP télomérase in vitro pour les tests d'activité télomérase. Un aperçu des méthodes expérimentales utilisées est montré dans la figure 1.
La méthode présentée ici permet de produire de grandes quantités de sous-unité catalytique de T. TERT télomérase castaneum sous forme soluble, actifs pour des études structurales et biochimiques. La méthode de Tc TERT sur-expression est sensible à des changements subtils dans la température ou la densité des cellules de ceux mentionnés ci-dessus et peut considérablement affecter les niveaux d'expression de protéines. Plus précisément, nous avons constaté que les cellules …
The authors have nothing to disclose.
La recherche présentée ici a été soutenu par le Pennsylvania Department of Health, The Medical Ellison, le V et le Fondations d'Emeraude.
Name of Reagent | Company | Catalog Number |
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Rosetta(DE3)plysS Cells | Novagen | 70956 |
2YT Broth | Teknova | Y0215 |
IPTG | Gold Biotechnology | I2481C |
MISONIX Sonicator 3000 | Qsonica, LLC. | |
ÄKTA Purifier FPLC | GE Life Sciences | |
Ni-NTA Superflow Resin | Qiagen | 30410 |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Device | Millipore | UFC903008 |
POROS 50 HS Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-3359-06 |
POROS 50 HQ Strong Cation Exchange Packing | Applied Biosystems | 1-2559-06 |
Superdex 200 10/300 Size-Exclusion Column | GE Life Sciences | 17-5175-01 |
Phenol: Chloroform: Isoamyl 25:24:1 with 10mM Tris, pH 8, 1mM EDTA | Sigma | P3803-100mL |
RNaseZap | Ambion | AM9780 |
Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N251B |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 |
DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies |