הדור ניסויית של קרצינומה-Associated Fibroblasts (CAFs) מ Fibroblasts החלב אנוש
Summary
קרצינומה הקשורים fibroblasts (CAFs) עשיר myofibroblasts להציג בתוך stroma הגידול, לשחק תפקיד מרכזי נהיגה התקדמות הגידול. פיתחנו מודל הגידול coimplantation xengraft עבור ניסיוני להפקת CAFs מן fibroblasts החלב האנושי. הפרוטוקול מתאר כיצד להקים myofibroblasts CAF כי תרכוש את היכולת לקדם tumourigenesis.
Abstract
קרצינומות הם רקמות מורכבות מורכבת של תאים neoplastic ו תא שאינם סרטניים המכונה "stroma". Stroma מורכב תאי מטריקס (ECM) ועוד מגוון של תאים mesenchymal, כולל fibroblasts, myofibroblasts, לתאי אנדותל, pericytes ו לויקוציטים 1-3.
Stroma הגידול הקשורים מגיב לאותות אוטוקריני משמעותי שפורסמו על ידי תאים קרצינומה השכנות. במהלך תהליך המחלה, stroma לעתים קרובות הופך מאוכלס קרצינומה הקשורים fibroblasts (CAFs) כולל מספר גדול של myofibroblasts. תאים אלה בעבר מופק הרבה סוגים שונים של קרצינומות האדם לתרבות במבחנה שלהם. Subpopulation של CAFs הוא להבחין באמצעות רגולציה-up שלהם אקטין α-שריר חלק (α-SMA) ביטוי 4,5. תאים אלה הם סימן ההיכר של 'fibroblasts מופעל' החולקים מאפיינים דומים עם myofibroblasts גצפו ommonly ברקמות פצועים fibrotic 6. הנוכחות של משנה זו CAF myofibroblastic קשורה מאוד בדרגה גבוהה ו ממאירות הקשורות התחזיות עניים חולים.
מעבדות רבות, כולל שלנו, הראו כי CAFs, כאשר הוזרקו תאים סרטן לעכברים immunodeficient, המסוגלים באופן משמעותי לקידום tumourigenesis 7-10. CAFs מוכן מחולים קרצינומה עם זאת, לעיתים קרובות עוברים הזדקנות במהלך התפשטות תרבות להגביל את השימוש בהם פשיטות ברחבי ניסויים מתמשך. כדי להתגבר על קושי זה, פיתחנו שיטה חדשנית כדי להפיק בניסוי הנציח קווי האדם החלב CAF תא (exp-CAFs) מ fibroblasts החלב האנושי, באמצעות השד coimplantation הגידול מודל xenograft.
על מנת ליצור exp-CAFs, הורים fibroblasts החלב אדם, המתקבל הרקמה מאמופלסטית ירידה, היו הראשונים immortalised עם hTERT, למקטע הקטליטית של holoenzyme telomerase, ומתוכננים להביע GFP ו גן התנגדות puromycin. תאים אלה היו coimplanted עם MCF-7 אנושי קרצינומה של תאים בשד הבעת האונקוגן ras מופעל (MCF-7-ras תאים) לתוך xenograft עכבר. לאחר תקופת דגירה in vivo, fibroblasts המוזרק בתחילה החלב אדם חולצו מן xenografts הגידול על בסיס התנגדות puromycin שלהם 11.
ראינו כי fibroblasts תושב החלב האדם מובחן, אימוץ פנוטיפ myofibroblastic ורכש הגידול בקידום נכסים במהלך התקדמות הגידול. חשוב לציין, התאים האלה, כהגדרתו exp-CAFs, מקרוב לחקות את הפנוטיפ הגידול קידום myofibroblastic של CAFs מבודד קרצינומות השד גזור מחולים. Xenograft הנגזרות הגידול שלנו exp-CAFs ולכן לספק מודל יעיל ללמוד את הביולוגיה של CAFs ב breas אדםלא קרצינומות. הפרוטוקול המתואר יכול להיות גם המורחבת להפקת ואפיון אוכלוסיות שונות CAF נגזר סוגים אחרים של קרצינומות האדם.
Protocol
Discussion
חוסר CAF הסמנים הספציפיים ורמת ההטרוגניות נצפתה בקרב CAFs להפוך את אפיון מסוג זה תא אתגר בפני עצמו. CAFs לימוד במבחנה יש גם התעכבה בשל סיבוך נוסף כי תאים אלו מזדקנים להפסיק מתרבים כאשר בתרבית במשך תקופה ארוכה. הניסיון הקודם שלנו ישירות להנציח CAFs ראשוני באמצעות לבנות re…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר רוברט א 'ויינברג (וייטהד מכון Biomedical Research, קיימברידג') תמיכה פיקוח נדיב של עבודה זו ומר Kieran Mellody (אוניברסיטת מנצ'סטר, מנצ'סטר) לעריכה ביקורתית של כתב היד הזה. פרויקט זה נתמך על ידי מחקר בבריטניה (CR-בריטניה) מספר מענק C147/A6058 (AO)
Materials
| Material Name | Typ | Company | Catalogue Number | Comment |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | ||
| Fetal calf serum | GIBCO | 10270 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Collagenase type I | Sigma | C0130-1G | ||
| hyaluronidase | Sigma | H4272 | ||
| Vimentin (V9) antibody | Novocastra Laboratories | NCL-L- VIM-V9 |
||
| Tenascin C (BC-8) antibody | a gift from |
|||
| α-SMA-Cy3 (1A4) antibody | Sigma | C6198 | ||
Prolyl-4-hydroxylase |
Dako | M0877 | ||
| (5B5) antibody | ||||
| Collagen type1 1A antibody | Sigma | HPA011795 | ||
| Pan-cytokeratin antibody | Sigma | C5992 | ||
| Fibronectin antibody | BD Biosciences | 610077 | ||
S100A4/FSP-1 (fibroblast- specific protein-1) antibody |
Dako | A5114 | ||
Fibroblast surface protein (clone 1B10) antibody |
Abcam | ab11333 | ||
| MSCV-IRES-GFP construct | Request to the the authors | |||
| pBabe-puro construct | Purchase from Addgene |
|||
| Puromycin | Sigma | P8833 | ||
| DAPI | Sigma | D9564 | ||
| 15 ml conical tube | Corning | 430766 | ||
| Nude mouse | Taconic | NCRNU-F | Female NCr nude | |
| C3H/10T1/2 cells | ATCC | CCL-226 |
Referenzen
- Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?. Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes – bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- De Wever, O. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. 18, 1016-1018 (2004).
- Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).
- Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. Co-evolution of tumor cells and their microenvironment. Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).
- Kojima, Y. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).
- Orimo, A. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
