In diesem Protokoll kombinieren wir RNAi-vermittelte Gen-Silencing mit ein In-vivo- Diurese Assay, um die Auswirkungen Knockdown von Genen von Interesse Studie wurde auf Moskito-Flüssigkeit ausgeschieden.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dieses Video demonstriert Protokoll eine effektive Technik, um ein bestimmtes Gen in einer Insekten und die Durchführung einer neuartigen Bioassay zur Ausscheidung zu messen. Diese Methode kann verwendet werden, um ein besseres Verständnis des Prozesses der Diurese bei Insekten erhalten werden und ist besonders nützlich bei der Untersuchung der Diurese in blutsaugende Arthropoden, die aufnehmen können große Mengen an Flüssigkeit in einem einzigen Blutmahlzeit sind.
Das RNAi-vermittelten Gen Knockdown mit einem In-vivo-Assay kombiniert Diurese wurde von der Hansen-Labor entwickelt, um die Effekte der RNAi-vermittelte Reduktion von Aquaporin-Gene auf Aedes aegypti Moskito Diurese 1 studierst.
Das Protokoll ist Setup in zwei Teile: der erste Beispiel demonstriert, wie man ein einfaches Moskitonetz Injektionsgerät konstruieren und zur Vorbereitung und injizieren dsRNA in den Brustkorb von Mücken für RNAi-vermittelte Gen-Knockdown. Das zweite Beispiel demonstriert, wie Sie feststellen,Ausscheidung in Moskitos mit einem In-vivo-Bioassay.
Protokoll
Teil I - RNAi-vermittelten Gen-Knockdown in der Erwachsenenbildung Aedes aegypti Mücken. Für Experiment Überblick siehe Abbildung 1.
1. dsRNA-Synthese
- Synthetisieren spezifische dsRNAs gegen Gene von Interesse und Kontrolle dsRNAs. Anmerkung: Es wird empfohlen die Entwicklung Primer für die PCR-Fragmente im Bereich von 300 bis 500 Basenpaare am 3'-Ende der spezifischen cDNA 2 und mit dem T7-Primer-Sequenz am 5 'befestigt Ende (5'-TAA TAC GAC TCA CTA befindet TAG GG-3 '). Die Einzigartigkeit der Fragmente sollte durch BLASTN Analyse 3 bestätigt werden.
- Verwenden Sie die Ambi....
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Diskussion
Die RNAi-Protokoll verwendet wurde im Labor von Alexander Raikhel wurde an der University of California Riverside 6,7 entwickelt und ist vergleichbar mit einem Protokoll, das von Garver und Dimopoulos 4 veröffentlicht. Der experimentelle Ansatz in diesem Video-Protokoll gezeigt werden verwendet, um Gene in Insektenzellen Diurese in einem in-vivo-Umgebung verwickelt zu werden. Die Ausscheidungsorgane der Insekten, die Malpighischen Gefäßen, haben das Interesse von Generationen von .......
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Die Autoren danken Victoria Carpenter für ihre kritischen Kommentare dieses Protokolls.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenz oder Ausrüstung | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
| MEGAscript T7 High-Yield-Kit | Ambion, Inc. | AM1334 | |
| PBS-Puffer | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Kunststoffschlauch | Lokale Anbieter | PVC | |
| 1 ml Kunststoff-Pipettenspitze | VWR | 83007-376 | Blaue Spitze |
| 1 ml-Spritze | Becton, Dickinson and Company | 309602 | |
| Schere | Lokale Anbieter | ||
| Metall-Nadel | Carolina Biologicals | 654307 | Größe 5 |
| Fly-Pad | Genesee Scientific | 789060 | |
| Batteriebetriebene Aspirator w / Sammelfläschchen | Upma Labs | IPMM 2000 | |
| Feine Spitze Pinzette | World Precision Instruments | 14095 | |
| Glaskapillare Nadeln | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
| Stereo Dissektionsmikroskop | Leica Microsystems | S6D | |
| Analytische Präzisionswaage | Mettler Toledo | AB54S | |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| Ein Pint gewachst ausgekleideten Karton Tassen | Lokale Anbieter | Hergestellt Suppentassen | |
| Mesh-Netz | Lokale Anbieter | Kunststoff-fly Gaze |
Referenzen
- Drake, L. L., et al. The Aquaporin gene family of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. PloS one. 5, e15578(2010).
- Shepard, A. R., Jacobson, N., Clark, A. F. Importance of quantitative PCR primer location for short interfering RNA ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
