Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz
Summary
Bu yöntem gerçek zamanlı ve bu hız, yer değiştirme ve hız gibi farklı hücre göçü parametrelerinin nicel ölçümleri hücrelerin izlenmesine olanak sağlar. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu gerçek zamanlı bir yaklaşım uç kantitatif göç ölçümlere dayalı değildir, bunun yerine izlenmesi ve sürekli farklı parametreler hesaplanarak sağlar.
Abstract
Hücre göçü embriyonik gelişme, doku onarımında, bağışıklık sistemi fonksiyonu, ve tümör invazyonu 1, 2 önemli dinamik bir süreçtir. Yönsel, geçiş sırasında hücreleri bir hücre dışı kemotaktik sinyaline yanıt olarak, ya da bazik motilitesi makine tarafından sağlanan intrinsik kuyrukları 3 yanıt olarak hızlı bir şekilde hareket eder. Bir hücre hücrelerin kendi yerel ortamında keşfetmek için izin, düşük içsel yönü sahip olduğunda Rastgele göç oluşur.
Hücre göçü ilk tepkisi hücre, kompleks bir süreçtir polarizasyon uğrar ve göç 2 yönünde çıkıntılar uzanır. Böyle Boyden çemberinin göç deneyi olarak göç ölçmek için geleneksel yöntemleri bir bitiş noktası sonucu olarak göç ölçüm sağlayan in vitro, in kemotaksis ölçmek için kolay bir yöntemdir. Ancak, bu yaklaşım ne bireysel göç parametrelerin ölçümünü sağlar, ne de visua izin vermezhücre göçü sırasında uğradığını morfolojik değişikliklerin Harp öncesi devresi.
Time lapse mikroskopi – Burada, bize video kullanarak gerçek zamanlı olarak göç hücreleri izlemeye olanak sağlayan bir yöntem sunuyoruz. Hücre göçü ve işgali kanseri işaretlerinden olduğu için, bu yöntem in vitro kanser hücre göçü ve işgali okuyor geçerli olacaktır. Trombositlerin Rastgele göç trombosit fonksiyonu 4 parametrelerinden biri olarak kabul edilmiştir, dolayısıyla bu metod aynı zamanda trombosit fonksiyonlarının incelenmesinde yararlı olabilir. Bu testte, hızlı, güvenilir, tekrar üretilebilir olma avantajına sahiptir, ve hücre sayısı optimizasyonu gerektirmez. Hücrelerin fizyolojik olarak uygun koşullar muhafaza etmek amacıyla, mikroskop CO 2 kaynağı ve sıcaklık termostat ile donatılmıştır. Hücre hareketi düzenli aralıklarla mikroskop takılan bir kamera ile fotoğraf çekerken tarafından izlenir. Hücre göçü ölçüm ortalama hız ve hesaplanabilirSlidebook yazılımı ile hesaplanır verage yer değiştirme,.
Protocol
Discussion
Gerçek zamanlı rastgele göç testi gibi hız ve yer değiştirme gibi hücre göçü parametrelerin doğru, duyarlı, analiz sağlar. Bu yöntem, nokta ölçüm değeri sonuna kadar sınırlı değildir, dolayısıyla daha nicel olduğunu. Bu yana, hücreler serumu ile normal bir DMEM ortam izlenir; serum boş ortam içinde uzun inkübasyon zararlı etkilerini azaltır. Bu, hücre göçü biçimlendirme ve böylece, bu yöntem, migrasyon farklı sübstrat etkisini araştırmak için kullanılan olabilir alt tabaka <s…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar deneyi ile ilk yardım Amanda Struckhoff teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NIH 5RO1CA115706 bir hibe ile desteklenmiştir.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | |
| FBS | Gemini Bio- Products | 100-106 | |
| Opti-Mem | Invitrogen | 31985-070 | |
| Collagen | BD | 354231 | |
| Microscope with Live Cell chamber & Automated XY stage controller | Olympus | Olympus 1X81 | |
| Environmental control chamber | Neue | Neue Live Cell Chamber | Ours has a custom built rectangular glass plate top for appropriate optics through the top of the chamber. The rectangular shape accommodates multi-well plates used in many of our experiments. |
| Automated XY stage | Prior | Prior Proscan | This allows precise return to multiply selected XY positions during time lapse microscopy. |
| Camera | Hamamatsu EM camera C9100 | ||
| Software | Typically purchased through microscope vendor such as Olympus | Slide Book 5 |
Referenzen
- Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. Cell migration: a physically integrated molecular process. Cell. 84, 359-369 (1996).
- Ridley, A. J. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Random versus directionally persistent cell migration. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).
- Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. Modulation of the random migration of human platelets. J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).
- Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. Acquisition speed comparison of microscope software programs. Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).
- Struckhoff, A. P. Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events. J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).
- Albini, A., Sporn, M. B. The tumour microenvironment as a target for chemoprevention. Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).
- Yu, Y. P., Luo, J. H. Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin. Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).
- Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX. J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).
- Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho. Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).
- Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration. J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).
- Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment. J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).
