In diesem Bericht beschreiben wir eine Methode zur Maus Ischiasnerv zu zerschlagen. Diese Methode verwendet leicht verfügbar Arterienklemmen und einfach und reproduzierbar produziert komplette Ischiasnerv verknallt. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode, um Muskeln ganzen Halterungen für die Analyse der Nervenregeneration nach Ischiasnerv verknallt vorzubereiten.
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Methodenartikel
Reproduzierbare Maus Ischiasnerv Crush und anschließende Bewertung der Regeneration von Whole mount Muskelanalyse
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Regeneration im peripheren Nervensystem (PNS) ist weit verbreitet sowohl für seine Relevanz für die menschliche Krankheit und die robuste regenerative Reaktion von PNS Neuronen damit möglicherweise die Beleuchtung der Ausfälle von ZNS-Regeneration 1 montiert verstehen, intensiv untersucht. Ischiasnerv Crush (Axonotmesis) ist eine der gängigsten Modelle von peripheren Nervenverletzungen bei Nagern 2. Crushing unterbricht alle Axone aber Schwann-Zell Basallaminae bleiben erhalten, so dass eine optimale Regeneration ist 3,4. Dies ermöglicht es dem Prüfer, um genau zu studieren: die Fähigkeit eines wachsenden Axons sowohl mit der Schwann-Zellen und Basallaminae 4 interagieren. Ratten waren im Allgemeinen die bevorzugten Tiermodellen für experimentelle Nervenquetschungs. Sie sind weit verbreitet und ihre lädierten Ischiasnerv bietet eine angemessene Annäherung an die menschliche Nervenläsionen 5,4. Obwohl in der Größe kleiner als Ratte Nerven, die Maus N. viele ähnliche Eigenschaften. Am wichtigsten ist jedoch, mousE-Modelle sind immer wertvoll, weil von der breiten Verfügbarkeit von transgenen Linien erlaubt nun eine detaillierte Analyse der einzelnen Moleküle von entscheidender Bedeutung für die Regeneration von Nerven 6, 7. Vor Ermittler haben mehrere Methoden verwendet, um eine Nervenquetschungs oder Verletzungen, einschließlich einfacher abgewinkelte Pinzetten, Zangen gekühlt, Arterienklemmen, Gefäßklemmen und Forschern entwickelt Klammern 8,9,10,11,12 produzieren. Die Ermittler haben auch verschiedene Methoden zur Markierung der verletzten Stelle mit Naht, Kohlenstoff-Teilchen und fluoreszierende Kügelchen 13,14,1 verwendet. Wir beschreiben unsere Methode, um eine komplette reproduzierbar Ischiasnerv verknallt genaue und anhaltende Kennzeichnung des Crush-Website mit einer feinen Pinzette hämostatischen und anschließender Kohlenstoff Crush-Ort-Kennzeichnung zu erhalten. Als Teil unserer Beschreibung der Ischiasnerv verknallt Verfahren haben wir auch eine relativ einfache Methode des Muskels enthalten ganze montieren wir nutzen, um anschließend zu quantifizieren Regeneration.
Protokoll
1. Tierische Themen
1.1. Behandlung
- Alle Tier-Verfahren sollten mit Zustimmung der lokalen Einrichtung des Animal Care und Ethik-Kommission und im Einklang mit der Nutzung und Ausschuss und National Institutes of Health Leitlinien durchgeführt werden, mit Maßnahmen ergriffen, um Schmerzen und Beschwerden zu minimieren.
- Unsere Mäuse wurden unter temperierten Bedingungen auf einem 12-Stunden-Reverse-Dunkel-Zyklus untergebracht, während die Fed Mäusefutter und Wasser ad libitum.
- Für Studien mit erwachsenen Regeneration, sollten Mäuse mindestens 6 Wochen alt sein, wenn der Ischiasnerv verknallt durchgeführt wird. D....
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Diskussion
Wir haben eine Methode, um eine komplette zuverlässig Ischiasnerv crush mit genauen Kennzeichnung des Crush-Site zu erhalten präsentiert. Wie bereits erwähnt, ist Ischiasnerv crush ein gemeinsames Modell der peripheren Nervenverletzungen bei Mäusen und Ratten. Obwohl jede Methode der Andrang hat seine Vorteile und Nachteile, fanden wir dieses Verfahren hergestellt werden eine komplette verknallt, die leicht mit einem Minimum an speziellen Geräten (zB spezielle Klemmen, etc.) gekennzeichnet war.
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Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde vom NIH K08NS065157 Zuschüsse (bis TAF) Außerdem unterstützt wurde, das Penn Center für Erkrankungen des Bewegungsapparats, Auszeichnung Anzahl P30AR050950 vom National Institute of Arthritis, Muskel-Skelett unterstützt und Hautkrankheiten diese Arbeit (TAF und Steven S. Scherer). Schließlich unterstützt Shriners Pediatric Research Center Seed-Finanzierung (TAF) diese Arbeit. Wir danken Herrn Dr. Young-Jin Sohn für zunächst zeigen, daß der ganze Berg Verfahren und Amy A. Kim für ihre Unterstützung bei der Erstellung der Skizzen von Abbildung 1 zu bestätigen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name (Beschreibung / Quantität) | Lieferant | Katalog-Nummer | |
| Mini Clipper mit Nr. 0000 Klinge | Roboz | RC-5903 | |
| Nair Haarentferner (9 oz.) | Kirche und Dwight Co., Inc. | N / A | |
| Betadine Surgical Scrub (1 Gallone) | Fisher Scientific | 19066452 | |
| Augensalbe (1 Unze) | Fisher Scientific | 19082795 |
Chirurgische Werkzeuge:
| Name (Beschreibung / Quantität) | Lieferant | Katalog-Nummer |
|---|---|---|
| FST 250 Hot Wulst Sterilisator | Fine Science Tools | 18000-45 |
| Iris Schere (11 cm lang) | World Precision Instruments | 500216 |
| Potts-Smith Pinzetten (Straight; 18cm; 1x2 Zähne) | Fine Science Tools | 11024-18 |
| McPherson-Vannas Schere (5 mm Klingen) | World Precision Instruments | 14.124-G |
| Dumont Nr. 5 Pinzetten - Dumoxel Standard Spitze | Fine Science Tools | 11252-30 |
| Dumont # 5/45 Pinzetten - Dumoxel Standard Spitze | Fine Science Tools | 11251-35 |
| Ultra Fine Hämostyptika (Straight, glatten Innenflächen) | Fine Science Tools | 13020-12 |
| Pulver-Aktivkohle (500 g) | Fisher Scientific | C272-500 |
| Größe 6-0 Nahtmaterial mit C-1 Nadel (steril, Seide, schwarz, geflochten,Nicht-resorbierbare, 18 "Länge, Box of 36) | Roboz | SUT-1073-1011 |
| Reflex Clip-Applikator (für 9 mm-Clips) | World Precision Instruments | 500345 |
| 9mm Edelstahl Reflex Clips (100/Schachtel) | World Precision Instruments | 500346 |
Animal Care:
| Name (Beschreibung / Quantität) | Lieferant | Katalog-Nummer |
|---|---|---|
| 0,9% Natriumchlorid-Injektion (ohne Konservierungsmittel, 20 mL) | Hospira | 0409-4888-20 |
| Komplette homöothermen Blanket-System mit flexibler Sonde (Medium, 115 VAC, 60 Hz) | Harvard Apparatus | 507222F |
Chirurgische Platform und Retraktoren:
(Gekauft bei örtlichen Baumarkt)
| Name (Beschreibung /) | Menge |
|---|---|
| Edelstahl-Plattform (gefräst; ~ 12 "x12" x1 / 8 ") | 1 |
| Button-Magnete (Beispiel: Eclipse E825) | 3 |
| Edelstahlschrauben (3 "Long; Durchmesser von Knopfmagnete Entschlossen) | 3 |
| Edelstahlmuttern (Sized zu Bolts Fit) | 9 |
| Gummibänder (Light Tension) | 3 |
| Insekten-Pins (beide Enden gebogen, um Haken zu bilden) | 3 |
Semi-Hauchdünn:
| Name (Beschreibung / Quantität) | Lieferant </ Strong> | Katalog-Nummer |
|---|---|---|
| Paraformaldehyd (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Wasserfreies Dinatriumhydrogenphosphat (500 g; verwendet, um Phosphatpuffer vorbereiten) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Mononatriumphosphat wasserfrei (1 kg; verwendet, um Phosphatpuffer vorbereiten) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| Glutaraldehyd (50%, 10 × 10 ml) | Ted Pella, Inc. | 18431 |
| Osmiumtetroxid (4% igen wässrigen, 10 x 10 ml) | Ted Pella, Inc. | 18465 |
| Propylenoxid (450 ml) | Ted Pella, Inc. | 18601 |
| Embed 812 (Kit, für harte Blöcke / hohen Bildkontrast) | Electron Microscopy Sciences | 14120 |
| Toluidine Blau (25 g) | Ted Pella, Inc. | 19451 |
Whole mount Muskel-Präparat und Immunhistochemie:
| Name (Beschreibung / Quantität) | Lieferant | Katalog-Nummer |
|---|---|---|
| Paraformaldehyd (1 kg) | Sigma-Aldrich | P6148-1KG |
| Wasserfreies Dinatriumhydrogenphosphat (500 g; verwendet, um Phosphatpuffer vorbereiten) | Fisher Scientific | S375-500 |
| Mononatriumphosphat wasserfrei (1 kg; verwendet, um Phosphatpuffer vorbereiten) | Fisher Scientific | AC38987-0010 |
| 10% BSA Diluent / Blocking Solution (200 ml) | Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. | 50-61-00 |
| Triton X-100 (100 ml) | Dot Scientific Incorporated | 9002-93-1 |
| Glycin, 98% (1 kg) | Fisher Scientific | AC12007-0010 |
| Tissue-Tek Cryo-OCT-Verbindung (Urteil vom 12, 4 Unzen-Flaschen) | Fisher Scientific | 14-373-65 |
| Sylgard DOW 170 (£ 2 Kit) | Fisher Scientific | NC9492579 |
| Edelstahl Insektennadeln, Größe 1 (100 St.) | Fine Science Tools | 26001-40 |
| Tetramethylrhodamin-A-Bungarotoxin (0,5 mg) | Sigma-Aldrich | T0195-.5MG |
| Maus monoklonaler Antikörper gegen SMI-312 (0,1 ml) | Covance | SMI-312R |
| Maus monoklonaler Antikörper gegen SV2 (0,1 ml) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | SV2 |
| Kaninchen Polyklonale Antikörper gegen GAP-43 | Novus Biologicals | NB300-143 |
| Fluorescein konjugierten Ziege anti-Maus IgG, Fc &ggr; Unterklasse 1. Spezifisches | Jackson ImmunoResearch | 11 5-095-205 |
| DyLight 649 konjugiertem Esel-anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-495-152 |
| 4 ',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, dilactate, 10 mg) | Invitrogen | D3571 |
| Vectashield Eindeckmedium (10 ml) | Vector Laboratories | H-1000 |
| Superfrost Plus Mikropräparate (Weiß, Größe: 75 x 25 mm; Packung mit 144) | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| Fisherfinest Premium-Deckgläser (Größe: 40 x 22 mm; Packung mit 1 Unze) | Fisher Scientific | 12 bis 548-5C |
Referenzen
- Pan, Y. A., Misgeld, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Effects of neurotoxic and neuroprotective agents on peripheral nerve regeneration assayed by time-lapse imaging in vivo. J. Neurosci. 23, 11479-11488 (2003).
- Magill, C., Tong, A., Kawamura, D., Hayashi, A., Hunter, D.
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Nachdrucke und Genehmigungen
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