Verwendung von Interferon-γ enzyme-linked immunospot Assay zur Novel T-Zell-Epitope des humanen Papillomvirus Charakterisieren

Zusammenfassung

Die Charakterisierung von T-Zell-Epitopen von Krankheitserregern, die lokalisierte Infektionen wie das humane Papillomvirus verursachen, ist aufgrund der begrenzten Anzahl von T-Zellen im Umlauf eine Herausforderung. Es wird eine Methode beschrieben, bei der seltene T-Zellen isoliert und charakterisiert wurden, ausgehend von einer sehr geringen Anzahl von Zellen.

Zusammenfassung

Es wurde ein Protokoll entwickelt, um die Schwierigkeiten bei der Isolierung und Charakterisierung seltener, auf Krankheitserreger spezifischer T-Zellen zu überwinden, wie beispielsweise humanes Papillomavirus (HPV), das lokal begrenzte Infektionen verursacht. Die beteiligten Schritte umfassen die Identifizierung von Region(en) in HPV-Proteinen, die T-Zell-Epitop(e) von einem Probanden enthalten, die Selektion peptidspezifischer T-Zellen basierend auf der Sekretion von Interferon-γ (IFN-γ) sowie das Anzüchten und die Charakterisierung der T-Zell-Klone (Abb. 1). Proband 1 war ein Patient, bei dem kürzlich mittels Biopsie eine hochgradige intraepitheliale Plattenepithelläsion diagnostiziert worden war und der am Tag der T-Zell-Gewinnung eine elektrische Schlingenexzision zur Behandlung erhalten hatte¹. Eine Region innerhalb der Proteine E6 und E7 des humanen Papillomavirus Typ 16 (HPV 16) wurde identifiziert, die ein T-Zell-Epitop enthält, und zwar mithilfe eines IFN-γ-Enzyme-Linked-Immunospot-(ELISPOT)-Assays, der mit überlappenden synthetischen Peptiden durchgeführt wurde (Abb. 2). Die Daten aus diesem Assay wurden nicht nur zur Identifizierung einer Region mit einem T-Zell-Epitop verwendet, sondern auch zur Abschätzung der Anzahl epitopspezifischer T-Zellen und zur Isolierung dieser Zellen anhand ihrer IFN-γ-Sekretion unter Verwendung kommerziell erhältlicher magnetischer Partikel (CD8-T-Zell-Isolationskit, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Die ausgewählten IFN-γ-sekretierenden T-Zellen wurden verdünnt und einzeln in Gegenwart eines bestrahlten Futterzellen-Gemischs kultiviert, um das Wachstum einer einzelnen T-Zelle pro Mulde zu ermöglichen. Diese T-Zell-Klone wurden mittels eines IFN-γ-ELISPOT-Assays getestet, wobei Peptide verwendet wurden, die die identifizierte Region abdecken, sowie autologe, mit Epstein-Barr-Virus transformierte B-Lymphoblastoide Zellen (LCLs, wie von Walls und Crawford beschrieben beschafft)², um die benötigte Anzahl an T-Zell-Klon-Zellen zu minimieren. Anstelle der üblicherweise im ELISPOT-Assay verwendeten 1 × 10⁵ Zellen pro Mulde^1,3 kamen 1.000 T-Zell-Klon-Zellen in Gegenwart von 1 × 10⁵ autologen LCLs zum Einsatz, wodurch die benötigte Anzahl an T-Zell-Klon-Zellen drastisch reduziert wurde. Die autologen LCLs dienten nicht nur der Präsentation von Peptidantigenen an die T-Zell-Klon-Zellen, sondern sorgten auch für eine hohe Zelldichte in den Mullen, wodurch die epitopspezifischen T-Zell-Klon-Zellen IFN-γ sezernieren konnten. Dies gewährleistet eine erfolgreiche Durchführung des IFN-γ-ELISPOT-Assays. Ebenso wurden IFN-γ-ELISPOT-Assays verwendet, um die minimale und optimale Aminosäuresequenz des CD8-T-Zell-Epitops (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) und sein HLA-Klasse-I-Restriktionselement (B58) zu charakterisieren. Der IFN-γ-ELISPOT-Assay wurde außerdem mit autologen LCLs durchgeführt, die mit Vaccinia-Virus infiziert waren, das das HPV-16-E6- oder E7-Protein exprimierte. Das Ergebnis zeigte, dass das E6-T-Zell-Epitop endogen prozessiert wurde. Die Kreuzerkennung homologer T-Zell-Epitope anderer hochriskanter HPV-Typen wurde nachgewiesen. Diese Methode kann ebenfalls zur Beschreibung von CD4-T-Zell-Epitopen verwendet werden⁴.

Protokoll

Durch die Durchführung eines IFN-γ-ELISPOT-Assays mit einer aus Proband 1 etablierten CD8-T-Zelllinie wurde festgestellt, dass die Region HPV 16 E6 46-70 ein T-Zell-Epitop enthält¹ (Abb. 2), und die epitopspezifischen T-Zellen wurden vor Beginn dieses Protokolls basierend auf der Sekretion von IFN-γ ausgewählt (Abb. 1).

1. Limitierende Verdünnung epitopspezifischer T-Zellen

1. Bereiten Sie die Fütterungszellmischung vor, indem Sie bestrahlte (4.000 rad) allogene periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/ml, bestrahlte (5.000 rad) allogene LC....

Diskussion

Traditionell versuchten Immunologen, neuartige T-Zell-Epitope zu charakterisieren, indem sie die betreffenden T-Zellen in vitro stimulierten und einen Grenzverdünnungsversuch durchführten, um die epitopspezifischen T-Zellklone zu isolieren. Anschließend wurden die T-Zellklone mittels Chromfreisetzungsassay charakterisiert^8,9. Viele Versuche blieben jedoch erfolglos, da die Frequenz der T-Zellen möglicherweise zu gering war, um sie isolieren zu können, oder weil nicht genügend T-Zellklonzellen zur Verf.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
CD8-T-Zell-Isolationskit	Miltenyi Biotec	130-094-156
Phytohämaggglutinin	Remel, Thermo Fisher Scientific	R-30852801	2 mg/Fläschchen
Yssel’s Medium	Gemini Bio Products	400-102	1 % humanes gepooltes Serum
Rundboden-96-Well-Platte	BD Biosciences	08-772-17
Rekombinantes humanes IL-2	R&D Systems	202-IL-050	50μg
24-Well-Platte	Corning	07-200-84
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Cellgro	MT-21-031-CV
Primärer monoklonaler Anti-IFN-γ-Antikörper (D1K)	Mabtech	3420-3-1000
Biotin-konjugierter monoklonaler Anti-IFN-γ-Antikörper (7B-6)	Mabtech	3420-6-1000
Multiscreen HA ELISPOT-Platte	EMD Millipore	MAHA S45 10
Dimethylsulfoxid	Sigma-Aldrich	D2650	100-ml-Flasche
Gepooltes Serum, human	Atlanta Biologicals	S40510H	Hitzeinaktivierung
RPMI 1640	Cellgro	MT-10-040-CV
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100ml
Vectastain Elite ABC Kit	Vector Laboratories	NC9313719
Stabiles Diaminobenzidin	Open Biosystems	MBI 1241
AID EliSpot Reader Classic	Autoimmun Diagnostika GmbH	ELR06