Wir stellen eine Methode, um ein bildgebendes Fenster in der Maus, die Schädel Millimeter überspannt und ist seit Monaten ohne Entzündung des Gehirns stabil zu bilden. Diese Methode wird auch für longitudinale Studien des Blutflusses, Zelluläre Dynamik und Zell / vaskuläre Struktur mit zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet.
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Methodenartikel
Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
In-vivo-Bildgebung der kortikalen Funktion erfordert optische Zugang zum Gehirn ohne Störung des intrakraniellen Umwelt. Wir stellen eine Methode, um eine polierte und verstärkte ausgedünnt Schädel (Ports) Fenster in der Maus Schädel, die mehrere Millimeter im Durchmesser überspannt und ist über Monate stabil zu bilden. Der Schädel auf 10 bis 15 um in der Dicke mit einer Hand gehalten Bohrer optische Klarheit zu erreichen verdünnt und dann mit Sekundenkleber und ein Deckglas zu überlagern: 1) für Steifigkeit, 2) zu verhindern Knochenwachstum und 3) zu reduzieren Lichtstreuung von Unregelmäßigkeiten auf der Knochenoberfläche. Da der Schädel nicht verletzt ist, wird jede Entzündung, die den Prozess beeinflussen könnten, untersucht stark reduziert. Imaging Tiefen von bis zu 250 mu m unterhalb der kortikalen Oberfläche kann mit Hilfe der Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie werden. Dieses Fenster eignet sich gut zur Hirndurchblutung und zelluläre Funktion in beide betäubt und wach Vorbereitungen zu studieren. Es bietet darüber hinaus den OPPortunity zu manipulieren Zellaktivität mit Optogenetik oder um den Blutfluss in ausgewählten Behältern durch Bestrahlung der zirkulierenden Photosensibilisatoren stören.
Protokoll
1. Vorbereitung für Chirurgie I
- Reinigen Sie die chirurgischen Instrumente im Ultraschallbad in einer Mischung aus Maxizyme und Chirurgische Milch in einem Ultraschallreiniger. Autoklavieren chirurgische Instrumente vor jedem Experiment.
- Stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Reagenzien und Verbrauchsmaterial zur Verfügung stehen. Eine Liste von Reagenzien und Verbrauchsmaterial ist in Tabelle 2 bereitgestellt. Reagenzien und Einwegartikel, die in Kontakt mit dem freiliegenden Gewebe zu kommen, sollte steril sein, wenn möglich.
- Induzieren Anästhesie. Typische Anästhetika für das Überleben sind in Tabelle 1 beschrieben. Ste....
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Diskussion
Zwei-Photonen-Bildgebung durch eine Ports Fenster erfordert die Übertragung durch den ausgedünnten Knochen und Dura, welches das Laserlicht dämpft und fügt optischen Aberrationen in größeren Tiefen 8. Doch trotz dieses Nachteils kann bildgebenden Tiefen bis zu 250 mu m unterhalb der Pia-Oberfläche mit 900 nm Anregung erreicht werden. Größere Tiefen Bildgebung kann im Prinzip möglich sein, mit mehr Anregungswellenlängen 13. Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist das Fehlen von kortikalen Entzün.......
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Offenlegungen
Nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (Postdoc-Stipendium an AYS) und der National Institutes of Health (MH085499, EB003832 und OD006831 zu DK) unterstützt. Wir bedanken uns bei Beth Friedman und Pablo Blinder für Anmerkungen zum Manuskript.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Agent | Route der Lieferung | Dosis für die Maus | Dauer | Hinweise | Quelle | Ref |
| Pentobarbital (Nembutal) | IP | 90 ug / g | 15-60 min | Schmale Sicherheitsmarge. Arbeiten Sie bis zu richtigen Dosis der Narkose langsam. Zuschlag 10% der Induktionsdosis wie erforderlich. | 036093; Butler Schein | 7 |
| Ketamin (Ketaset) mit Xylazin (Anased) gemischt | IP | 60 ug / g (K) 10 ug / g (X) (Mischung in derselben Spritze) | 20-30 min | Xylazin wird als Muskelrelaxans und Analgetikum co-injiziert. Zuschlag nur Ketamin bei 50% der Induktion Dosis erforderlich. | (K) 010.177, (X) 033.198; Butler Schein | 7 |
| Isofluran (Isothesia) | Inhalation | 4% bedeuten alveolare Konzentration (MAC) für die Induktion; 1-2% MAC für die Wartung | 06.04 Uhr. | Bildquelle in einer Mischung aus 70% Sauerstoff und 30% Distickstoffmonoxid. Längerer Betäubung führt zur Genesung verlangsamen. | 029403; Butler Schein | 26 |
Tabelle 1. Empfohlene Anästhetika für das Überleben Studien.
| ITEM | UNTERNEHMEN | Catalog # / MODELL |
|---|---|---|
| Betadine | Butler Schein | 6906950 |
| Buprenorphin (Buprenex) | Butler Schein | 031919 |
| Fluoresceinisothiocyanat Dextran, 2 MDa Molekulargewicht | Sigma | FD2000S |
| Isopropylalkohol | Fischer | AC42383-0010 |
| Ringer-Laktat-Lösung | Butler Schein | 009846; |
| Lidocain-Lösung, 2% (v / v) | Butler Schein | 002468 |
| Saline | Butler Schein | 009861 |
| Chirurgische Milk | Butler Schein | 014325 |
| Texas Red Dextran, 70 kDa Molekulargewicht | Invitrogen | D1864 |
| Maxizyme | Butler Schein | 035646 |
| EINWEGARTIKEL | ||
| Hartmetallfräser, 1/2 mm Düsengröße | Fine Science Tools | 19007-05 |
| Cottoned Spitze Applikatoren | Fisher Scientific | 23-400-100 |
| Deckglas, nein. 0 Dicke | Thomas Scientific | 6661B40 |
| Sekundenkleber | ND Industries | 31428 H04308 |
| Gas-Staubtuch | Newegg | N82E16848043429 |
| Grip Zementpulver | Dentsply | 675571 |
| Grip Zement Lösungsmittel | Dentsply | 675572 |
| Insulinspritze, 0,3 ml Volumen mit 29,5 Gauge-Nadel | Butler Schein | 018384 |
| Mutter und Schraube, um den Kopf zu sichern | Digikey | Nuss-, H723-ND, Bolzen, R2-56X1/4-ND |
| Ophthalmische Salbe | Butler Schein | 039886 |
| Skalpellklingen | Fisher Scientific | 12-460-448 |
| Schrauben, selbstschneidend # 000 | JI Morris Company | FF000CE125 |
| Silikon-Dichtstoff Aquarium | Perfecto Fertigung | 31001 |
| Zinnoxidpulver | Mamas Minerals | EQT-TiNOX |
| EQUIPMENT | ||
| Glas-Schreiber | Fisher Scientific | 08-675 |
| Seziermikroskop | Carl Zeiss | OPMI-1 FC |
| Elektrische Bohrmaschine | Foredom oder Osada | K.1020 (Foredom) oder EXL-M40 (Osada) |
| Elektrische Rasierer | Wahl | Serie 8900 |
| Pinzetten, Dumont-Nr. 55 | Fine Science Tools | 11255-20 |
| Ihre Meinung geregelten Heizkissen | FHC | 40-90-8 (rektal Thermistor, 40-90-5D-02; hessen-Pad, 40-90-2-07) |
| Isofluran Verdampfer | Ohmeda | IsoTec4 |
| Pulsoximeter | Starr Life Sciences | MouseOx |
| Schraubendreher, Miniatur | Garret Wade | 26B09.01 |
| Stereotaktischen Rahmen | Kopf Instruments | Modell 900 (mit der Maus Narkosemaske und Nicht-Bruch Ohr Bars) |
| Chirurgische Schere, stumpfen Ende | Fine Science Tools | 14078-10 |
| Ultraschallreiniger | Fisher Scientific | 15-335-30 |
Tabelle 2. Liste der spezifischen Reagenzien, Verbrauchsmaterialien und Geräten.
Referenzen
- Cetin, A. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nature Protocols. 1, 3166-3173 (2006).
- Kleinfeld, D., Delaney, K. R. Distributed representation of vibrissa movement in the upper layers of somatosensory cortex re....
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Nachdrucke und Genehmigungen
