Glasvezel-implantatie voor chronische Optogenetic Stimulatie van hersenweefsel
Summary
De ontwikkeling van optogenetics biedt nu de middelen om nauwkeurig te stimuleren genetische gedefinieerde neuronen en circuits,<em> In vitro</em> En<em> In vivo</em>. Hier beschrijven we de montage en implantatie van een glasvezel voor chronische fotostimulering van hersenweefsel.
Abstract
Het ophelderen van de patronen van neuronale connectiviteit is een uitdaging voor zowel de klinische en fundamentele neurowetenschappen. Elektrofysiologie is de gouden standaard voor het analyseren van patronen van synaptische connectiviteit, maar gekoppeld elektrofysiologische opnames kunnen zowel omslachtig en experimenteel te beperken. De ontwikkeling van optogenetics introduceert een elegante methode om neuronen en circuits stimuleren, zowel in vitro en in vivo een 2,3. Door gebruik celtype specifieke promoter activiteit opsin expressie in discrete neuronale populaties kan men nauwkeurig stimuleren genetisch gedefinieerde neuronale subtypes in verschillende circuits 4-6. Goed beschreven methoden neuronen, inclusief elektrische stimulatie en / of farmacologische manipulaties, stimuleren vaak willekeurig celtype, invasieve en kunnen beschadigen omliggende weefsels. Deze beperkingen kunnen veranderen normale synaptische functie en / of circuit gedrag. Bovendien wegensde aard van de manipulatie, de huidige methoden vaak acute en terminal. Optogenetics biedt de mogelijkheid om neuronen te stimuleren in een relatief onschadelijke wijze en in genetisch gerichte neuronen. De meeste studies met in vivo optogenetics momenteel een optische vezel geleid via een canule geïmplanteerd 6,7, maar beperkingen van deze methode zijn beschadigd hersenweefsel met herhaalde inbrengen van een optische vezel en potentiële breuk van de vezel binnen de canule. Gezien de snel groeiende gebied van de optogenetics, een meer betrouwbare methode van chronische stimulatie is noodzakelijk om op lange termijn studies te vergemakkelijken met een minimale collaterale weefselbeschadiging. Hier geven we onze gemodificeerd protocol als video artikel de werkwijze effectief en elegant beschreven in Sparta et al. vullen. 8 voor de vervaardiging van een glasvezel implantaat en zijn vaste bevestiging op de schedel van verdoofde muizen, en de montage van de fiberoptische koppeling verbinden van het implantaat aan een lichtbron. Het implantaat, verbonden met optische vezels om een solid-state laser, maakt een efficiënte methode om functionele neuronale circuits chronisch photostimulate met minder weefselschade 9 met kleine, afneembare tethers. Permanente bevestiging van de glasvezel implantaten zorgt voor een consistente, op lange termijn in vivo optogenetic studies van neuronale circuits in wakker, gedragen muizen 10 met minimale weefselbeschadiging.
Protocol
Discussion
Optogenetics is een krachtige nieuwe techniek die ongekende controle over specifieke neuronale subtypes mogelijk maakt. Dit kan worden benut moduleren neurale circuits met anatomische en temporele precisie, maar worden de celtype willekeurige en invasieve effecten van elektrische stimulering door een elektrode. Implantatie van glasvezel zorgt voor consistente, chronische stimulering van neurale circuits meerdere sessies in wakker gedragen muizen met minimale schade aan weefsel. Dit systeem, dat oorspronkelijk ontwikkeld…
Acknowledgements
We willen bevestigen dat deze techniek oorspronkelijk beschreven door Sparta et al.., 2012 en is gemakkelijk worden aangepast voor gebruik in ons laboratorium.
Materials
| Name of the Reagent or Equipment | Company | Catalogue # | Comments |
| LC Ferrule Sleeve | Precision Fiber Products (PFP) | SM-CS125S | 1.25 mm ID |
| FC MM Pre-Assembled Connector | PFP | MM-CON2004-2300 | 230 μm Ferrule |
| Miller FOPD-LC Disc | PFP | M1-80754 | For LC ferrules |
| Furcation tubing | PFP | FF9-250 | 900 μm o.d., 250 μm i.d. |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-1270 | 127 μm ID Bore |
| MM LC Stick Ferrule 1.25 mm | PFP | MM-FER2007C-2300 | 230 μm ID Bore |
| Heat-curable epoxy, hardener and resin | PFP | ET-353ND-16OZ | |
| FC/PC and SC/PC Connector Polishing Disk | ThorLabs | D50-FC | For FC ferrules |
| Digital optical power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | Spectrophotometer |
| Polishing Pad | ThorLabs | NRS913 | 9″ x 13″ 50 Durometer |
| Aluminum oxide Lapping (Polishing) Sheets: 0.3, 1, 3, 5 μm grits | ThorLabs | LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P | |
| Standard Hard Cladding Multimode Fiber | ThorLabs | BFL37-200 | Low OH, 200 μm Core, 0.37 NA |
| Fiber Stripping Tool | ThorLabs | T10S13 | Clad/Coat: 200 μm / 300 μm |
| SILICA/SILICA Optical Fiber | Polymicro Technologies | FVP100110125 | High -OH, UV Enhanced, 0.22 NA |
| 1×1 Fiberoptic Rotary Joint | doric lenses | FRJ_FC-FC | |
| Mono Fiberoptic Patchcord | doric lenses | MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC | |
| Heat shrink tubing, 1/8 inch | Allied Electronics | 689-0267 | |
| Heat gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 W; 750-800 °F |
| Cotton tipped applicators | Puritan Medical Products Company | 806-WC | |
| VetBond tissue adhesive | Fischer Scientific | 19-027136 | |
| Flash denture base acrylic | Yates Motloid | ColdPourPowder+Liq | |
| BONN Miniature Iris Scissors | Integra Miltex | 18-1392 | 3-1/2″(8.9cm), straight, 15 mm blades |
| Johns Hopkins Bulldog Clamp | Integra Miltex | 7-290 | 1-1/2″(3.8 cm), curved |
| MEGA-Torque Electric Lab Motor | Vector | EL-S | |
| Panther Burs-Ball #1 | Clarkson Laboratory | 77.1006 | |
| Violet Blue Laser System | CrystaLaser | CK473-050-O | Wavelength: 473 nm |
| Laser Power Supply | CrystaLaser | CL-2005 | |
| Dumont #2 Laminectomy Forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | |
| Probe | Fine Science Tools | 10140-02 | |
| 5″Straight Hemostat | Excelta | 35-PH | |
| Vise with weighted base | Altex Electronics | PAN381 |
Referenzen
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity. Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).
- Arenkiel, B. R. In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2. Neuron. 54, 205-218 (2007).
- Gradinaru, V. Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics. Cell. 141, 165-16 (2010).
- Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. Genetic dissection of neural circuits. Neuron. 57, 634-660 (2008).
- Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy. Nature. 461, 900-907 (2009).
- Zhang, F. Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures. Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).
- Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons. Nature. 450, 420-424 (2007).
- Sparta, D. R. Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits. Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).
- Stuber, G. D. Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking. Nature. 475, 377-380 (2011).
- Liu, X. Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall. Nature. 484, 381-385 (2012).
