Das am häufigsten verwendete Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von autologen dendritischen Zellen (DCs) zur Verwendung bei Tumor-Immuntherapie beschrieben. Das Verfahren nutzt IL-4 und GM-CSF zu DCs aus Monozyten differenzieren. Die unreifen DCs sind, um zu reifen und dann mit Antigenen beladen stimuliert, bevor sie zurück in den Patienten injiziert werden.
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Methodenartikel
Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Obwohl klinische Studien festgestellt haben, dass Antigen-beladenen DC Impfstoffe sicher und viel versprechende Therapie für Tumore 1 sind, bleibt ihre klinische Wirksamkeit festgelegt werden. Das nachfolgend beschriebene Verfahren, hergestellt gemäß Good Manufacturing-Verfahren (GMP)-Richtlinien, ist eine Optimierung der häufigste ex vivo Herstellungsverfahren zur Erzeugung einer großen Anzahl von DCs für klinische Studien 2.
Unsere Methode nutzt die synthetischen TLR-Agonisten Polyinosin 3-Polycytidylsäure-Poly-L-Lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC), um die DCs zu stimulieren. Unsere früheren Studie festgestellt, dass Poly-ICLC die stärkste einzelne Reifung Stimulus für den menschlichen DCs ist, wie durch eine Hochregulation von CD83 und CD86, Induktion von Interleukin-12 (IL-12), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Interferon-gamma-induzierten beurteilt Protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) und Typ-I-Interferonen (IFN) und minimal Interleukin 10 (IL-10) Produktion. DCs sind aus gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von Leukapherese erhalten differenziert. PBMCs durch Ficollgradientenzentrifugation isoliert und in Aliquots eingefroren. Am Tag 1 werden PBMCs aufgetaut und überzogen auf Gewebekulturflaschen für Monozyten, die auf der Kunststoffoberfläche nach 1-2 h Inkubation bei 37 ° C in der Gewebekulturinkubator haften wählen. Nach der Inkubation werden die Lymphozyten durch Waschen entfernt und die anhaftenden Monozyten werden für 5 Tage in Gegenwart von Interleukin-4 (IL-4) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) zu unreifen DC differenzieren kultiviert. Am Tag 6 werden unreife DCs mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH)-Protein, das als eine Kontrolle für die Qualität der Impfstoff dient und die Immunogenität der Impfstoff 3 steigern gepulst. Die DCs stimuliert werden, um zu reifen, beladen mit Peptid-Antigene, und über Nacht inkubiert. Am 7. Tag wurden die Zellen gewaschen und in 1 ml eingefroren Aliquots, welche4 - 20 x 10 6 Zellen mit einer kontrollierten Rate Gefrierschrank. Lot Release-Tests für die Chargen von DCs durchgeführt und müssen Mindestanforderungen erfüllen, bevor sie in die Patienten injiziert werden.
Protokoll
1. Isolation und Kryokonservierung von PBMCs 4
- Aseptisch Spike einer der Access-Ports in der Leukapherese Tasche mit einem Plasma-Transfer-Set. Mit einem 60-ml-Spritze, übertragen Sie die Leukapherese von Patienten in eine sterile 500 ml-Flasche erhältlich.
- Stellen Sie die Lautstärke des Leukapherese auf sein ursprüngliches Volumen mit Raumtemperatur RPMI 2x. Gründlich mischen.
- Vorsichtig mischen die Flasche Ficoll-Paque PLUS. In 12 ml Ficoll-Paque PLUS in sterile 50 ml konischen Röhrchen.
- Vorsichtig Schicht 30 ml des verdünnten Leukapherese Produkt zu jedem sterile 50 ml konischen Röhrchen mit Ficoll. Achten Sie da....
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Ergebnisse
Zwischen 10 - 20% Ausgangsmaterial PBMCs differenzieren in DCs am Ende der Kulturperiode. Reife DCs sind CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 + und CCR7 + (Abbildung 1). Sie exprimieren hohe Mengen von MHC-Klasse-I und-II-Molekülen und den kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. Poly-ICLC auch unteren Ebenen der PDL-1 induziert zu anderen TLR-Agonisten 14 verglichen. Darüber hinaus führen diese Poly-IC-gereiften DCs sezernieren große Mengen an IL-12 (Abbildung 2 und 15,16)
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Diskussion
Phase-I-und-II-Studien von Monozyten-abgeleiteten DCs haben gezeigt, dass sie Immunreaktionen induzieren in Patienten jedoch klinische Erfolg wurde 1 beschränkt. Dies kann zum Teil auf den Mangel an Konsens darüber, wie die optimalen DCs für die Tumor-Immuntherapie Verwendung erzeugen. Obwohl es zahlreiche Möglichkeiten, um klinische Studien zu DCs zu erzeugen, unterscheiden sich diese Verfahren im Hinblick auf die Verwendung von Zytokinen, die Monozyten, Stimuli, um die Reifung zu induzieren, und die Methode.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben die finanzielle Unterstützung aus der folgenden erhalten: NIH (AI061684, AI071078, AI044628 und K08 AI084578 (Miller)), die Bill and Melinda Gates Foundation, Doris Duke Charitable Foundation, Cancer Research Institute, Alliance for Lupus Research und der Smaragd Foundation. Nina Bhardwaj ist ein Miterfinder von Patenten im Zusammenhang mit der Herstellung und Verwendung von dendritischen Zellen, die Immunität zu manipulieren. Die Autoren haben keine anderen relevanten Zugehörigkeiten oder finanzielle Beteiligung mit keiner Organisation oder Einrichtung mit einer finanziellen Beteiligung an oder finanzielle Konflikt mit dem Gegenstand oder Materialien im Manuskript abgesehen von denen offenbart diskutiert.
Danksagungen
Die Autoren bedanken sich bei Andres Salazar (Oncovir, Inc.) für das Geschenk des Poly-ICLC danken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| RPMI-1640 Medium mit L-Glutamin | BioWhittaker | 12-702F | |
| 1M HEPES gepufferte Kochsalzlösung | BioWhittaker | 17-737E | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) | BioWhittaker | 17-516F | |
| Humanalbumin, 25% ige Lösung USP | Aventis Behring | ||
| Ficoll-Hypaque PREMIUM | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Humanes AB-Serum | Valley Biomedical | HP1022 | |
| Sterile Kochsalzlösung USP | Hospira | ||
| CryoMACS DMSO | Miltenyi Biotec | 170-076-303 | |
| Leukin GM-CSF, 0,5 mg/ml | Berlex | A02266 | |
| MACS GMP IL-4 | Miltenyi Biotec | 170-076-101 | |
| Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml | Oncovir | NA | |
| VACMUNE KLH | Biosyn | ||
| 225 sq cm EasyFlasks | Nalgene Nunc | 159934 | |
| Falcon 6-Well-Gewebekulturplatten | Becton Dickinson | 353046 | |
| 1,8 ml CryoTube Fläschchen | Nalgene Nunc | 377267 | |
| Tiefkühlschrank | Thermo | CryoMed |
Referenzen
- Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
- Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy
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Nachdrucke und Genehmigungen
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