Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell

Zusammenfassung

Eine schnelle Weg zum Bildschirm für die Melanom-Modifikatoren mit einem Zebrafisch autochthonen Tumormodell vorgestellt. Es nutzt die miniCoopR Vektor, der zur Expression von Melanom-Kandidat Gene in Melanozyten ermöglicht. Verfahren zur Melanom Überleben Kurven, eine Invasion Assay, ein Protokoll für Antikörperfärbung Maßstab von Melanozyten und Melanomzellen eine Transplantation Assay erhalten werden beschrieben.

Zusammenfassung

Genomic Studien der menschlichen Krebsarten haben eine Fülle von Informationen über die Gene, die in Tumoren ^1,2,3 verändert werden erbracht. Eine Herausforderung, die aus diesen Studien ist, dass viele Gene verändert werden, und es kann schwierig sein, genetische Veränderungen, Tumorgenese aus, dass diejenigen entstanden zeitweilig während der Transformation fuhren zu unterscheiden. Um diesen Unterschied zu zeichnen ist es vorteilhaft, einen Assay, die quantitativ messen kann die Wirkung eines veränderten Gens auf Tumorinitiation und andere Prozesse, die Tumoren zu persistieren und verbreiten ermöglichen müssen. Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle Möglichkeit, eine große Anzahl von Kandidaten Melanom Modifikatoren im Zebrafisch mit einem autochthonen Tumormodell ^4, Schritte zur Melanom Initiierung und Wartung umfasst screenen. Ein Schlüssel Reagenz in diesem Assay ist die miniCoopR Vektor, welche Paare eine Wildtyp-Kopie des mitfa Melanocyt Spezifikation Faktor an einen Gateway Rekombinationskassette in welche Kandidaten melAnomalien Gene ⁵ rekombiniert werden. Der Vektor weist eine miniCoopR mitfa rettende Minigen, der den Promoter, offenen Leserahmen und 3'-untranslatierten Region des Wildtyp-mitfa Gen enthält. Es ermöglicht uns, Konstrukte mit voller Länge open reading frames von Kandidaten Melanom Modifikatoren. P53 (lf);; mitfa (lf) Zebrafischembryonen: Diese einzelnen Klone können dann in einzelne Zelle Tg (BRAF ^V600E mitfa) injiziert werden. Die miniCoopR Vektor wird von Tol2-vermittelte Transgenese ⁶ integriert und rettet Melanozyten. Weil sie physisch mit dem mitfa rettende Minigen gekoppelt sind, werden Kandidatengene gerettet Melanozyten, von denen einige zu transformieren und entwickeln sich zu Tumoren exprimiert. Die Wirkung eines Kandidatengens auf Melanom Initiierung und Melanomzelle Eigenschaften können unter Verwendung Melanom Überleben Kurven Invasionsassays, Antikörperfärbung und Transplantation Assays werden.

Protokoll

Ein. Screening für Melanom Onset Modifiers

1. Erstellen Gateways Mitteleinstieg Klone durch PCR Amplifikation des Volllängen-offenen Leserahmen von Genen von Interesse (GOI) und Rekombinieren in pDONR 221 mit BP Clonase II (Invitrogen). Verwenden Multisite Gateway-Technologie (Invitrogen) zu rekombinieren p5E_mitfa, pME_GOI, Tol2kit Nr. 302 p3E_SV40polyA ⁶ und miniCoopR ⁵ bis Genen von Interesse unter der mitfa Promotors Platz in der miniCoopR Vektor (Abbildung 1A).
2. Injizieren 25 Picogramm eines jeden Klons zusammen mit 25 Picogramm Tol2 Transposase mRNA in ein-Zell Tg (mitfa: BRA....

Ergebnisse

Ein-Zell-Tg (mitfa: BRAF ^V600E); p53 (lf); mitfa (lf) Zebrafischembryonen wurden mit dem Vektor, der die miniCoopR Melanom Onkogen SETDB1 5 oder EGFP, jeder unter der Kontrolle des Promotors mitfa injiziert. Embryonen mit Melanozyten Rettung wurden ausgewählt und reifen lässt. Bei 2 Monate alten Tieren mit Melanocyt Rettungs größer als 4 mm ^2, wurden ausgewählt. Die Tiere wurden untersucht wöchentlich für Melanome. Tumorinzidenz Kurven für den Erwachsenen zeigte,.......

Diskussion

Die miniCoopR Methode ermöglicht die Expression von Genen von Interesse im Zebrafisch Melanozyten. Dieser Ansatz nutzt die Tatsache, dass der Zebrafisch mitfa Gen-Zelle autonom wirkt. Aus diesem Grund sind Melanozyten durch die geretteten miniCoopR Vektor um das bestimmte Minigen und jedes Gen von Interesse, auf die sie physisch gekoppelt ist, enthalten. Gerettet Melanozyten sind deutlich sichtbar und können bei Tieren, die als Einzel-Zell-Embryonen injiziert wurden erzielt werden. Eine angegebene Grad der Chim.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Gateway-Rekombination Reagenzien	Invitrogen
miniCoopR			Referenz 5
Mitfa Antikörper			Referenz 5
FITC Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper	Invitrogen
Vectashield	Vector Labs	H-1000
casper Zebrafisch			Referenz 9
701N 10 ul Spritze	Hamilton / Fisher	14-824
40 uM Filter	BD Falcon / Fisher	352340
FBS	Invitrogen	26140079