Screening für Melanom Modifiers mit einem Zebrafisch Autochthone Tumormodell
Summary
Eine schnelle Weg zum Bildschirm für die Melanom-Modifikatoren mit einem Zebrafisch autochthonen Tumormodell vorgestellt. Es nutzt die miniCoopR Vektor, der zur Expression von Melanom-Kandidat Gene in Melanozyten ermöglicht. Verfahren zur Melanom Überleben Kurven, eine Invasion Assay, ein Protokoll für Antikörperfärbung Maßstab von Melanozyten und Melanomzellen eine Transplantation Assay erhalten werden beschrieben.
Abstract
Genomic Studien der menschlichen Krebsarten haben eine Fülle von Informationen über die Gene, die in Tumoren 1,2,3 verändert werden erbracht. Eine Herausforderung, die aus diesen Studien ist, dass viele Gene verändert werden, und es kann schwierig sein, genetische Veränderungen, Tumorgenese aus, dass diejenigen entstanden zeitweilig während der Transformation fuhren zu unterscheiden. Um diesen Unterschied zu zeichnen ist es vorteilhaft, einen Assay, die quantitativ messen kann die Wirkung eines veränderten Gens auf Tumorinitiation und andere Prozesse, die Tumoren zu persistieren und verbreiten ermöglichen müssen. Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle Möglichkeit, eine große Anzahl von Kandidaten Melanom Modifikatoren im Zebrafisch mit einem autochthonen Tumormodell 4, Schritte zur Melanom Initiierung und Wartung umfasst screenen. Ein Schlüssel Reagenz in diesem Assay ist die miniCoopR Vektor, welche Paare eine Wildtyp-Kopie des mitfa Melanocyt Spezifikation Faktor an einen Gateway Rekombinationskassette in welche Kandidaten melAnomalien Gene 5 rekombiniert werden. Der Vektor weist eine miniCoopR mitfa rettende Minigen, der den Promoter, offenen Leserahmen und 3'-untranslatierten Region des Wildtyp-mitfa Gen enthält. Es ermöglicht uns, Konstrukte mit voller Länge open reading frames von Kandidaten Melanom Modifikatoren. P53 (lf);; mitfa (lf) Zebrafischembryonen: Diese einzelnen Klone können dann in einzelne Zelle Tg (BRAF V600E mitfa) injiziert werden. Die miniCoopR Vektor wird von Tol2-vermittelte Transgenese 6 integriert und rettet Melanozyten. Weil sie physisch mit dem mitfa rettende Minigen gekoppelt sind, werden Kandidatengene gerettet Melanozyten, von denen einige zu transformieren und entwickeln sich zu Tumoren exprimiert. Die Wirkung eines Kandidatengens auf Melanom Initiierung und Melanomzelle Eigenschaften können unter Verwendung Melanom Überleben Kurven Invasionsassays, Antikörperfärbung und Transplantation Assays werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die miniCoopR Methode ermöglicht die Expression von Genen von Interesse im Zebrafisch Melanozyten. Dieser Ansatz nutzt die Tatsache, dass der Zebrafisch mitfa Gen-Zelle autonom wirkt. Aus diesem Grund sind Melanozyten durch die geretteten miniCoopR Vektor um das bestimmte Minigen und jedes Gen von Interesse, auf die sie physisch gekoppelt ist, enthalten. Gerettet Melanozyten sind deutlich sichtbar und können bei Tieren, die als Einzel-Zell-Embryonen injiziert wurden erzielt werden. Eine angegebene Grad der Ch…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Leonard I. Zon in dessen Labor diese Techniken wurden ursprünglich entwickelt, Kristen Kwan und die späten Chi-Bin Chien für Geschenke von Plasmiden in dieser Arbeit verwendet; James Lister und David Raible für die Unterstützung bei Antikörper-Färbung und James Neiswender für die Mikroinjektion Video. Diese Arbeit wurde vom NIH R00AR056899-03 bis CJC finanziert
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Gateway recombination reagents | Invitrogen | ||
| miniCoopR | Reference5 | ||
| Mitfa antibody | Reference5 | ||
| FITC goat anti-rabbit IgG antibody | Invitrogen | ||
| Vectashield | Vector Labs | H-1000 | |
| casper Zebrafish | Reference9 | ||
| 701N 10 μl Syringe | Hamilton/Fisher | 14-824 | |
| 40 μM filter | BD Falcon/Fisher | 352340 | |
| FBS | Invitrogen | 26140079 |
Referenzen
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