Hier beschreiben wir ein robustes Verfahren für die Fraktionierung von pflanzlichen Plasmamembranen in Waschmittel-und Reinigungsmittel beständig löslichen Membranen auf der Basis einer Mischung von unmarkierten und in vivo vollständig 15 N markierten Arabidopsis thaliana Zellkulturen. Das Verfahren ist für die vergleichende Proteom-Studien angewendet, um Signalprozesse zu verstehen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Metabolische Markierung und Membran Fraktionierung für Vergleichende Proteomanalyse von
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Plasmamembran-Mikrodomänen sind Funktionen, basierend auf den physikalischen Eigenschaften der Lipid-Sterol-und Umwelt und haben bestimmte Rollen in Signalprozessen. Extrahieren Sterol angereicherte Membrandomänen von Pflanzenzellen zur Proteom-Analyse ist eine schwierige Aufgabe, vor allem aufgrund von mehreren Vorbereitungsschritte und Quellen für Verunreinigungen von anderen zellulären Kompartimenten. Die Plasmamembran bildet nur etwa 5-20% aller Membranen in einer Pflanzenzelle, und daher Trennung von hoch gereinigten Plasmamembranfraktion ist eine Herausforderung. Ein häufig verwendetes Verfahren beinhaltet wässrigen Zweiphasentrennung in Polyethylenglykol und Dextran, das Plasmamembran-Vesikel mit einer Reinheit von 95% 1 ergibt. Sterol-reichen Membranmikrodomänen in der Plasmamembran unlöslich sind bei der Behandlung mit kaltem nichtionische Detergentien bei alkalischen pH-Wert. Dieser Detergenz-resistenten Membranfraktion aus dem Großplasmamembran durch Ultrazentrifugation getrennt werden, wie inucrose Steigung 2. Anschließend kann Proteine aus der geringen Dichte Band des Saccharose-Gradienten von Methanol / Chloroform Fällung extrahiert werden. Extrahierte Protein wird dann Trypsin gespalten werden, entsalzt und schließlich durch LC-MS/MS analysiert. Unsere Extraktionsprotokoll für Sterol-reiche Mikrodomänen wird zur Herstellung von sauberen Detergenz-resistenten Membranfraktionen aus Arabidopsis thaliana Zellkulturen optimiert.
Wir verwenden vollständige metabolische Markierung von Arabidopsis thaliana Suspensionszellkulturen, die mit K 15 NO 3 als einzige Stickstoffquelle für die quantitative Proteomik vergleichende Studien nach der biologischen Behandlung von Zins 3. Durch Mischen gleicher Verhältnisse von markierten und unmarkierten Zellkulturen für die gemeinsame Proteinextraktion der Einfluss der Herstellungsschritte auf die endgültige quantitative Ergebnis wird auf einem Minimum gehalten. Auch Materialverlust während der Extraktion werden die beiden Kontroll-und Behandlungs Proben in der gleichen Weise einen Einflussd daher das Verhältnis von Licht und heben Peptid konstant. Bei dem vorgeschlagenen Verfahren entweder markiert oder unmarkiert Zellkultur erfährt eine biologische Behandlung, die andere dient als Steuer 4.
Einleitung
Im Jahr 1972, Jonathan Singer und Garth Nicolson schlug die Flüssig-Mosaik-Modell ein Strukturmodell von Zellmembranen, anstelle der Protein-Lipid-Protein-Sandwich-Modell, das in der Regel in den frühen 1960er Jahren angenommen wurde. Singer und Nicolson postuliert, dass die biologische Membran kann als eine zweidimensionale Flüssigkeit in dem alle Lipid-und Protein-Moleküle frei und leicht diffundieren 5 betrachtet werden. Seit dieser Zeit Strukturmodell der Plasmamembran und der Kenntnis der Membranzusammensetzung wurde noch komplexer. Insbesondere in der Plasmamembran-Strukturen, wie Protein-und Lipidkomplexe / Sterol basierend strukturell ungeordnete M....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
VERFAHREN
Gemeinsame Reagenzien und Puffer in der Extraktionsprotokoll verwendet:
- JPL Medium für Arabidopsis thaliana Suspensionskulturen
- 3 &mgr; M H 3 BO 3
- 3 uM MnSO4 x H 2 O
- 1,1 &mgr; M ZnSO 4 x 7 H 2 O
- 0,15 uM KJ
- 0,03 &mgr; M Na 2 MoO 4 x 2 H 2 O
- 3 nM CoCl 2 x 6 H 2 O
- 3 nM CuSO 4 x 5 H 2 O
- 0,9 mM CaCl 2 x 2 H 2 O
- 0,5 mM MgSO 4 x 7 H 2 ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Mit der vorgestellten Protokoll mit metabolisch markierten Arabidopsis-Zellkulturen ist es möglich, die Plasmamembranen aus Pflanzengewebe (Schritt 2, Fig. 2 und 4) zu isolieren und anzureichern Waschmittel beständig Membranfraktionen innerhalb der Plasmamembran (Schritt 3, Fig. 3 und 5). Anschließend kann das Protokoll Extraktion von Proteinen aus diesen Waschmittel beständig Membranfraktionen (Schritt 4) und die Verdauung des Proteins für die vergleichende Proteomik-Analyse (.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Die in diesem Papier Protokoll enthält viele Schritte und alle von ihnen entscheidend für reine und Vertreter Fraktionierung der Plasmamembran Anlage in Waschmittel beständig Membranen und Reinigungsmittel lösliche Fraktionen zu erhalten sind. Daher ist es wichtig, jeden Schritt zu folgen, wie angewiesen.
Behandlung der Plasmamembranfraktion mit nicht-ionischen Detergens (Schritt 3.2) den stärksten Einfluss auf die Qualität der Membran Mikrodomänen Fraktionierung. Um reproduzierbare Ergebnis.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.
Der Autor, Witold Szymanski ist ein Mitarbeiter des Max-Planck-Institut für Molekulare Pflanzenphysiologie. Der Autor, ist Waltraud Schulze Mitarbeiter an der Universität Hohenheim, Deutschland.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Chemikalien wurden bei Sigma-Aldrich bestellt, sofern nicht anders | |||
| Ammoniak (Lager 25 % Lösung) | WAKO | 010-03166 | |
| TiO2 10 μ m | GL-Science | 5020-75010 | |
| Empore Disk C18 | Varian | 12145004 | |
| Polyethylene glycol(PEG 3350) | Sigma | 88276 | |
| Dextran T500 | Roth | 9219.2 | |
| Trypsin | Promega | V5113 | |
| Proteaseinhibitor Cocktail (PIC) | Sigma | P9599 | |
| K15NO3 | Cambridge Isotope Laboratories | NLM-765-PK | |
| EQUIPMENT | |||
| Optima L-80 XP Ultrazentrifuge | Beckman | ||
| Plate Reader | BioTek | ||
| EASY-nLC II Nano-Flüssigchromatograph | Thermo Scientific | ||
| LTQ-Orbitrap Massenspektrometer | Thermo Scientific | ||
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | ||
| Centrifuge 5417R | Eppendorf | ||
| Thermomixer | Eppendorf | ||
| Speed Vac RVC 2-25 | Christ | ||
| Shaker Unimax 2010 | Heidolph |
Referenzen
- Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
- Brown, D. A., Rose, J. K.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
