एक प्रोटोकॉल बड़े पैमाने पर जीनोटाइपिंग प्रदर्शन करने Illumina के इंफिनियम assays का उपयोग करता है वर्णन किया गया है. ये assays मज़बूती से तीन दिनों में व्यक्ति के डीएनए नमूने के सैकड़ों भर SNPs के लाखों जीनोटाइप कर सकते हैं. एक बार उत्पन्न, इन जीनोटाइप विभिन्न रोगों या phenotypes की एक किस्म के साथ संगठनों के लिए जाँच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
मानव जीनोम में जीनोटाइपिंग वेरिएंट phenotypes साथ आनुवंशिक संघों की पहचान करने के लिए एक कारगर तरीका साबित हो गया है. परिवारों या आबादी के भीतर वेरिएंट का वितरण रोग के आनुवांशिक कारकों की पहचान की सुविधा कर सकते हैं. जीनोटाइपिंग BeadChips की Illumina के पैनल जांचकर्ताओं हजारों या एकल nucleotide बहुरूपताओं के लाखों (SNPs) जीनोटाइप या डीएनए के नमूने की एक बड़ी संख्या में ऐसे प्रतिलिपि संख्या के रूप में अन्य जीनोमिक वेरिएंट, विश्लेषण करने की अनुमति देता है. इन SNPs जीनोम भर में फैल या संभावित खोज को अधिकतम करने के क्रम में विशिष्ट क्षेत्रों में लक्षित किया जा सकता है. इंफिनियम परख जल्दी से उच्च गुणवत्ता, सटीक परिणाम के लिए अनुकूलित किया गया है. उचित स्थापना के साथ, एक ही तकनीशियन सरणी के प्रकार के आधार पर, प्रति सप्ताह एक हजार से अधिक डीएनए नमूनों के लिए कुछ सौ से प्रक्रिया कर सकते हैं. यह परख जीनोमिक डीएनए के साथ शुरू करने और सरणी की स्कैनिंग के साथ समाप्त, हर कदम के माध्यम से गाइड प्रयोक्ताओं. मर्यादा Reage का प्रयोगएनटीएस, नमूने परिलक्षित कर रहे हैं, खंडित, उपजी resuspended, दाग एक एकल आधार, द्वारा बढ़ाया चिप, संकरित, और एक iscan या हाय स्कैन उच्च संकल्प ऑप्टिकल इमेजिंग प्रणाली या तो पर स्कैन किया. एक रातोंरात कदम डीएनए बढ़ाना आवश्यक है. डीएनए विकृत और isothermally पूरे जीनोम प्रवर्धन से परिलक्षित होता है, इसलिए कोई पीसीआर की आवश्यकता है. नमूने एक दूसरे रातोंरात चरण के दौरान सरणियों संकरित कर रहे हैं. तीसरे दिन के नमूने, और स्कैन का विश्लेषण करने के लिए तैयार हैं. प्रवर्धित डीएनए मनका सरणियों जिससे throughput को अधिकतम, सप्ताह के प्रत्येक दिन संसाधित करने की अनुमति देता है, बड़ी मात्रा में खरीदकर भंडार हो सकता है.
एकल nucleotide बहुरूपताओं (SNPs) लिखकर रोग के साथ जुड़े जोखिम वेरिएंट की पहचान करने का एक महत्वपूर्ण तरीका है. ऐतिहासिक, जीनोटाइपिंग प्रयोगों की गुंजाइश उपलब्ध तकनीक के द्वारा ही सीमित कर दिया गया है. जेल वैद्युतकणसंचलन आधारित जीनोटाइपिंग तरीकों नमूना और SNP-throughput में सीमित कर रहे हैं [1]. इन assays का विकास अक्सर अनुकूलन के लिए संस्करण आसपास के क्षेत्र के मेकअप और संरचना पर निर्भर है, श्रम प्रधान हो सकता है [1]. जीवन टेक्नोलॉजीज द्वारा विकसित TaqMan जीनोटाइपिंग assays, जल्दी और कम से कम तकनीशियन की भागीदारी के साथ नमूने की एक बड़ी संख्या को चला सकते हैं [2], लेकिन SNP-बहुसंकेतन प्रतिबंध प्रति दिन अच्छी तरह के तहत एक लाख [3,4 करने के जीनोटाइप की कुल संख्या को सीमित करने के लिए जारी ]. कम से कम एक सौ SNPs एक साथ मल्टिप्लेक्स जा सकता है के रूप में Sequenom के IPLEX मंच भी, एक ही बार में कई नमूने चलाते हैं, लेकिन हो सकता है, throughput के समग्र तुलनात्मक रूप से कम है [5]. Beckman कल्टर SNP धारा प्रौद्योगिकीसैद्धांतिक रूप से प्रति दिन तीन लाख से अधिक जीनोटाइप उपज सकता है, लेकिन प्रतिक्रिया प्रति केवल अड़तालीस SNPs की एक अधिकतम करने के लिए इस तकनीक सीमा परियोजना रेंज [4,6]. Goldengate परख नमूना प्रति SNPs के सैकड़ों या हजारों पर प्रत्येक दिन लगभग दो सौ डीएनए नमूने की प्रक्रिया कर सकते हैं जबकि एक बार [4,7 पर तीन हजार SNPs जब टाइपिंग, जीनोटाइप प्रति कीमत उन्नत, अल्ट्रा उच्च throughput तकनीक के साथ प्रतिस्पर्धी नहीं है ]. प्रति दिन कई लाख जीनोटाइप संसाधित करने के लिए, बड़े जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन के लिए आवश्यक पैमाने पर, सरणी संकरण assays के बाजार पर सबसे अधिक लागत प्रभावी विकल्प बन गए हैं.
संकरण सरणियों की Affymetrix की लाइन और इंफिनियम आधारित सरणियों की Illumina की लाइन के नमूनों की संभावित सैकड़ों समानांतर [4,8] में SNPs के हजारों या लाखों लोगों के सैकड़ों पर टाइप करने की अनुमति दे. इन SNPs ऐसे पूर्व के रूप में हितों के क्षेत्रों में स्थानीय, पूरे जीनोम भर में बिखरे हुए किया जा सकता हैomes, या उपयोगकर्ता के वरीयता के लिए अनुकूलित. ये सरणियों सही पर एक बार नमूना प्रति एक लाख SNPs जीनोटाइप, लेकिन यह भी संभावित अनावरण गुणसूत्र असामान्यताओं प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन को मापने के लिए सक्षम होने के लिए न केवल का लाभ उठा रहे हैं. इंफिनियम गठबंधन ओमनी BeadChip सरणियों वर्तमान में प्रत्येक दिन करीब एक सौ नमूनों को पर, पांच लाख कस्टम स्थलों सहित नमूना प्रति लगभग पांच लाख मार्कर, अप करने के लिए जीनोटाइप करने की क्षमता है.
ज्यादातर बीमारियों एक आनुवंशिक घटक है, इन बड़े पैमाने पर प्रयोग रोग के साथ जुड़े जीन खोजने में महत्वपूर्ण हो सकता है. उच्च throughput जीनोटाइपिंग नमूने में कुशल जीनोटाइप पीढ़ी के लिए अनुमति देता है आसानी से कम मामूली एलील आवृत्तियों पर आनुवंशिक एसोसिएशन का पता लगाने के लिए काफी बड़े खेलें. पूरे जीनोम जीनोटाइपिंग परियोजनाओं सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मामला नियंत्रण एलील की आवृत्ति या प्रतिलिपि संख्या मतभेदों के साथ क्षेत्रों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है [9,10,11]. राष्ट्रीय मानव जीई के अनुसारनोम अनुसंधान संस्थान, जीनोम चौड़ा संघ अध्ययन एक पी मूल्य कम से कम 1 एक्स 10 -5 साथ 8283 SNPs की खोज से stemming, 25 नवंबर, 2008 और 25 जनवरी 2013 के बीच 1,490 अलग प्रकाशनों के लिए नेतृत्व (http:// देखना ऊंचाई से एक जीनोम चौड़ा विश्लेषण द्वारा सकती व्यापक दृष्टिकोण से लाभान्वित वृषण कैंसर, को लेकर स्थिति शोध किया जो www.genome.gov/gwastudies/). ये अध्ययन. टाइपिंग की गुंजाइश भी प्रतिबंधात्मक हो गया था जैसे कि इन मामलों में, ब्याज की संपूर्ण क्षेत्रों नोटिस बच सकता. बड़े पैमाने पर एसोसिएशन विश्लेषण के लिए इस प्रकार, एक जीनोम चौड़ा जीनोटाइपिंग तकनीक पसंद की तकनीक है.
इंफिनियम परख के विभिन्न संस्करणों के प्रत्येक सरणियों के विशिष्ट प्रकार के साथ उपयोग के लिए करना, मौजूद हैं. या 24 नमूना सरणी चिप्स – नीचे गहराई में चर्चा की InfiniumUltra परख,, कई 12 के लिए उपयुक्त है. ये अक्सर डीएनए नमूना प्रति हजार एक सौ से अधिक SNPs जीनोटाइप और टी पर ध्यान केंद्रितऐसे exome या कस्टम पैनलों को argeted क्षेत्रों,. अन्य परख संस्करणों में इस तरह के पूरे जीनोम जीनोटाइपिंग सरणियों के रूप में अन्य चिप प्रकार, के लिए आवश्यक हो सकता है. सभी इंफिनियम assays के एक आम आधार का हिस्सा है और मुख्य रूप से केवल अभिकर्मक के नाम, अभिकर्मक की मात्रा, या सटीक धुंधला अभिकर्मक प्रक्रिया से अलग लेकिन, जैसा कि एक परख संस्करण पर सिद्ध तकनीक अक्सर समान रूप से लागू किया जा सकता है. ऐसे मेथिलिकरण सरणियों के रूप में अन्य सरणियों,,, साथ ही लगभग एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग हो सकता है. केयर चिप प्रकार उपयोग में लिए आवश्यक परख के संस्करण का उपयोग केवल के लिए लिया जाना चाहिए. इस तरह के जीन अभिव्यक्ति के स्तर को मापने वाले के रूप में कुछ प्रकार, एक nonInfinium प्रोटोकॉल के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है.
नमूने बैचों में संसाधित किया जाना चाहिए. उदाहरण के लिए, InfiniumUltra परख के साथ, prehybridization अभिकर्मक ट्यूबों 96 नमूने को चलाने के लिए पर्याप्त मात्रा में होते हैं, और ट्यूब refrozen नहीं किया जा सकता. इसलिए, नमूने एक समय में 96 नमूनों के बैच में चलाया जाना आवश्यक है. नमूने एफआइआर पर परिलक्षित होगाटी दिन. Benchwork के लगभग 1 घंटे बाद, नमूने 20-24 घंटे के लिए एक संवहन ओवन में गर्म किया जाना चाहिए. अगले दिन, लगभग 4 घंटा precipitating, और नमूने भविष्य में उपयोग के लिए जमे हुए या चिप संकरित किया जा सकता है या तो जो बात नमूने, resuspending, fragmenting खर्च किया जाएगा. चिप्स लोड हो रहा नमूने 16-24 घंटे के लिए रात भर संकरित किया जाएगा, जिसके बाद लगभग 2 घंटे लगते हैं. तीसरे दिन, धुंधला हो जाना और विस्तार कदम ~ 4 घंटा लेता है. एक और घंटे धोने, कोटिंग, और चिप्स सुखाने खर्च किया जाएगा. अंत में, सरणियों का इस्तेमाल किया प्रकार के आधार पर 15-60 मिनट / चिप से लग सकता है, जो स्कैन कर रहे हैं.
मानक प्रयोगशाला सुरक्षा और सफाई सावधानियों लागू होते हैं. प्रवर्धन पीसीआर आधारित नहीं है, पूर्व और postamplification प्रक्रियाओं के लिए अलग कार्यस्थानों संदूषण की संभावना को कम करने के लिए आवश्यक हैं. प्रयोग में हर किट की आपूर्ति की अभिकर्मक की पहचान संख्या एक ट्रैकिंग शीट पर लॉग इन करना होगा. Reageएनटीएस वितरण से पहले कई बार उपयोग करने से पहले तुरंत thawed और उल्टे जाना चाहिए. टाइप किया जा करने के लिए डीएनए मानक तरीकों से अलग है और एक fluorometer साथ मात्रा उच्च गुणवत्ता जीनोमिक डीएनए (260/280 1.6-2.0 के absorbance अनुपात, 3.0 से नीचे के 260/230 absorbance के अनुपात), होना चाहिए. डीएनए की गिरावट अक्सर कम गुणवत्ता परख परिणामों में एक योगदान कारक है. यह राशि कुछ चिप प्रकार के लिए भिन्न हो सकते हैं, हालांकि आमतौर पर, डीएनए के 200 एनजी, आवश्यक है. एक Tecan तरल से निपटने रोबोट प्रोटोकॉल के कई चरणों को स्वचालित और एक कारक के रूप में मानव त्रुटि को कम कर सकते हैं.
बड़े पैमाने पर जीनोटाइपिंग अनुप्रयोगों बेहतर कई मानव रोगों अंतर्निहित आनुवंशिक तंत्र को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है. एक जीनोम चौड़ा संघ विश्लेषण के माध्यम से किसी भी महत्वपूर्ण संस्करण की खोज से आगे के अध्ययन के लिए एक उम्मीदवार क्षेत्र झंडा सकते हैं. इसके अलावा, जीनोटाइप डेटा अनुक्रमण परियोजनाओं पर गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक अच्छा साधन है.
नमूना throughput को अधिकतम करने के लिए, कई नमूना प्लेटों प्रवर्धित और उनके खंडित, resuspended राज्यों में संग्रहित किया जा सकता है. आठ प्लेटों कई बैचों के लिए प्रोटोकॉल के पहले 24 घंटे के संयोजन और चिप प्रसंस्करण की ~ 2-8 दिनों के लिए पर्याप्त सामग्री उपलब्ध कराने, एक ही दिन में परिलक्षित किया जा सकता है. प्रवर्धित प्लेटें पहले से खरीदकर भंडार कर रहे हैं, और नए नमूने स्कैनिंग पिछले रन पर शुरू होता है तुरंत बाद चिप्स संकरित रहे हैं, प्रसंस्करण अतिरिक्त नमूना तैयार करने के लिए थामने के लिए आवश्यकता के बिना लगातार चला सकते हैं. इसलिए, हालांकि नमूने पूरा गुजरना करने के लिए तीन दिन का समय लगेगापरख, डेटा दैनिक उत्पन्न किया जा सकता है. Assuming24 चिप्स हर दिन संसाधित कर रहे हैं, एक 5 दिन workweek एक 12 नमूना मनका चिप पर चलाने के लिए 1,000 से अधिक डीएनए के नमूने के लिए अनुमति देता है. किसी भी कदम या अभिकर्मक में नाकाम रही है, तो किसी भी सुधार लागू किया जा सकता से पहले, हालांकि, कई बैचों खराब प्रदर्शन के लिए खतरा हो सकता है. सरणियों स्कैन या विश्लेषण कर रहे हैं जब तक त्रुटियाँ नोटिस बच सकता है, throughput अधिकतम है, इसलिए, प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों में नमूने के सैकड़ों पहले से ही खोज पर एक ही दोषपूर्ण उपचार प्राप्त हो सकता है. खो अभिकर्मकों और डेटा बरामद नहीं किया जा सकता है, उपयोगकर्ता एक त्वरित कार्यप्रवाह के लिए जरूरत के खिलाफ इन जोखिम पर भी गौर करना चाहिए.
GenomeStudio विश्लेषण सॉफ्टवेयर सचमुच जीनोटाइपिंग प्रक्रिया की सफलता गेज करने के लिए पहला मौका है. नॉर्म थीटा तीव्रता भूखंडों बनाम नॉर्म आर ठीक से समूह है, तो यह मान SLI बदलता है, हालांकि नमूनों की औसत कॉल दर (कुल SNPs के प्रतिशत सफलतापूर्वक टाइप किया), 99% दृष्टिकोण चाहिएghtly सरणी प्रकार पर निर्भर करता है. 85-90% से कम एक कॉल दर के साथ किसी भी नमूने से डेटा भरोसेमंद नहीं है और खारिज किया जाना चाहिए. गुणवत्ता नियंत्रण के प्रयोजनों के लिए, परिणाम संभव किसी भी पहले से ज्ञात जीनोटाइप जब भी तुलना की जानी चाहिए. ऐसी कोई डेटा मौजूद है, जानबूझकर नमूना दोहराव थाली या सरणी नियुक्तियों की पुष्टि करने में एक उपयोगी उपकरण है. ये नकली जोड़े अलग चिप्स, प्लेटें, बैच, या परियोजनाओं पर रखा जाना चाहिए, उनके जीनोटाइप पीढ़ी पर जाँच की. विशिष्ट क्यूसी बाधाओं अन्वेषक की वरीयता के अनुसार भिन्न है, जबकि आम SNP बाधाओं नमूना कॉल सफलता, हार्डी वेनबर्ग संतुलन, या मामलों और नियंत्रण के बीच missingness, पर आधारित हैं आम नमूना बाधाओं कॉल दरों, मेंडेलियाई विसंगतियों, या पार संदर्भ के आधार पर कर रहे हैं, जबकि नैदानिक लिंग डेटा को एक्स गुणसूत्र heterozygosity की [13].
किसी भी समस्या पैदा होती है, विश्लेषण सूट में पाया नियंत्रण डैशबोर्ड, को प्रस्तुत किया जा सकता हैकारण का पता लगाने के क्रम में कंपनी. इन नियंत्रणों अक्सर likeliest कदम या अभिकर्मक विफलता को मुद्दा नीचे संकीर्ण कर सकते हैं. ब्याज की किसी भी SNPs एक इंफिनियम जीनोटाइपिंग प्रयोग के माध्यम से पाए जाते हैं, उनकी तीव्रता भूखंडों दोबारा जांच आगे अनुसंधान का आयोजन किया जाता है इससे पहले क्लस्टरिंग त्रुटियों के लिए GenomeStudio में होना चाहिए.
एक असफल इंफिनियम जीनोटाइपिंग प्रयोग की वजह से मानव संसाधन त्रुटि या खराब गुणवत्ता वाले इनपुट डीएनए की संभावना है. नमूना मात्रा का ठहराव सही और सटीक होना चाहिए. सर्वोत्तम परिणामों के लिए, किसी भी अभिकर्मकों किसी भी नमूने में जोड़ा या चिप प्रोटोकॉल द्वारा निर्धारित मात्रा में तिरस्कृत किया जाना चाहिए. Pipettes ठीक से calibrated किया जाना चाहिए. अभिकर्मकों समाप्ति के बाद चलाया जा नहीं करना चाहिए और एक बार thawed refrozen नहीं किया जाना चाहिए, RA1 अभिकर्मक के लिए बचा. संभव धुंधला हो जाना और विस्तार त्रुटियों को कम करने के लिए, formamide / EDTA मिश्रण को हर महीने नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए. सभी -20 डिग्री सेल्सियस अभिकर्मकों केवल मैनुअल defrost फ्रीजर में संग्रहित किया जाना चाहिए. सेंट में इस्तेमाल सभी Labwareaining, प्रोटोकॉल का विस्तार, और धोने के अंश तुरंत अप्रचार पर पानी और हल्के साबुन के साथ अच्छी तरह से rinsed होना चाहिए. HYB कक्ष में humidifying जलाशयों एक टेस्ट ट्यूब ब्रश और हल्के साबुन के साथ झाड़ी की जानी चाहिए. एक सप्ताह में एक बार, उनके उपयोगकर्ता मैनुअल के निर्देशानुसार गिलास स्लाइड, 10% ब्लीच के साथ धोया जाना चाहिए.
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य के लिए अनुदान एनआईएच P20 GM103456, एनआईएच RC2 AR058959, और एनआईएच R56 AI063274 द्वारा प्रदान की गई है
Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |