Die Aktivität der einzelnen Neuronen aus erwachsenen Alters Mäusen kann durch distanziert Neuronen aus bestimmten Hirnregionen und unter Verwendung von fluoreszierenden Farbstoff Membranpotential Bildgebung untersucht werden. Durch Prüfung Antworten auf Veränderungen in Glucose, kann diese Technik verwendet, um die Glucoseempfindlichkeit von Erwachsenen ventromedialen Hypothalamus-Neuronen zu untersuchen.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Membrane Potential Dye Imaging von Ventromedial Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen zu Glucose Sensing Studieren
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Studium der neuronalen Aktivität werden oft unter Verwendung von Neuronen aus Nager weniger als 2 Monaten aufgrund der technischen Schwierigkeiten mit zunehmender Bindegewebe verbunden und verringerte neuronale Lebensfähigkeit, die mit dem Alter auftreten. Hier beschreiben wir eine Methodik für die Dissoziation von gesunden Neuronen des Hypothalamus von Erwachsenen-Alter von Mäusen. Die Fähigkeit, Neuronen aus adulten Mäusen untersucht Alters erlaubt den Einsatz von Krankheitsmodellen, die in einem höheren Alter manifestieren und könnte für bestimmte Studien mehr entwicklungs genau sein. Fluoreszenz-Imaging von dissoziierten Neuronen verwendet werden, um die Aktivität einer Population von Neuronen zu untersuchen, im Gegensatz zur Verwendung der Elektrophysiologie an einem einzigen Neuron zu untersuchen. Dies ist besonders nützlich bei der Untersuchung eines heterogenen neuronalen Population in dem die gewünschte neuronale Aktivität ist selten wie Glucose Sensor-Neuronen des Hypothalamus. Wir verwendeten Membranpotential Farbstoff Bildgebung des ventromedialen Hypothalamus erwachsenen Neuronen, um ihre Reaktionen zu studieren changes in der extrazellulären Glucose. Glucose Sensing-Neuronen werden geglaubt, um eine Rolle in der zentralen Regulierung der Energiebilanz spielen. Die Fähigkeit, Glukose-Mess bei erwachsenen Nagetieren zu studieren, ist besonders nützlich, da die Dominanz von Krankheiten, die dysfunktionalen Energiebilanz (zB. Adipositas) nehmen mit dem Alter zusammen.
Einleitung
Das Gehirn reguliert Energie-Homöostase durch die neuroendokrinen und autonomen Nervensystem. Ventromedialen Hypothalamus (VMH), des ventromedialen Nukleus (VMN) und dem bogenförmigen Kern (ARC) umfassen, ist für die zentrale Überwachung der Energie Homöostase. Specialized Glukosemess Neuronen im VMH, link neuronale Aktivität und peripheren Glukose-Homöostase ein. Es gibt zwei Arten von Glucose Sensor-Neuronen, Glucose angeregt (GE) Neuronen zu erhöhen, während Glukose gehemmt (GI) Neuronen ihre Aktivität verringern, wie extrazelluläre Glukose steigt. VMH Glucose Sensor-Neuronen sind in der Regel mit Hilfe der Elektrophysiologie oder Calcium / Membranpoten....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Tiere
- Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Ausschuss an der Universität für Medizin und Zahnmedizin von New Jersey zugelassen.
- Gruppenhaus männlichen C57BL / 6 Mäuse auf einem 12-Stunden-Licht/12 hr dunklen Zeitplan und damit freien Zugang zu Wasser und Nahrung. Sacrifice bei 4-5 Monaten. Euthanasie der Mäuse wurde unter Verwendung der Operationsebene Anästhesie und eine sekundäre Form der Euthanasie (dh dringende Einschnitt in den Brustraum durch die Membran). Dies steht im Einklang mit den Richtlinien AVMA zur Euthanasie.
2. Vorbereitung der Perfusionslösung,....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Die genaue Präparation des VMH von anderen Bereichen des Hypothalamus ist wichtig, um konsistente Ergebnisse zu erhalten. Die Einbeziehung von anderen Bereichen könnte die VMH neuronalen Population zu verdünnen, die Änderung der Verzehr% der Neuronen berechnet. Weiterhin wurden Glucose erfassenden Neuronen im Hypothalamus anderen Regionen, wie beispielsweise die lateralen Hypothalamus, die funktionell und mechanistisch von VMH Glucosesensorneuronen abweichen identifiziert. Fig. 1 zeigt die korrekten ana.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Der Schlüssel zu der Möglichkeit, Aktivität von Nervenzellen aus adulten Mäusen untersucht werden, ist die Fähigkeit, gesunde Neuronen zu distanzieren. Die Dissoziation von Hypothalamus Neuronen aus erwachsenen Mäusen ist an mehreren wichtigen Schritte im Protokoll schwieriger im Vergleich zu Neuronen aus jungen Mäusen. Wir haben dieses Problem auf mehrere Arten zu überwinden. Machen 500 um dicken Hirnschnitten minimiert mechanische Schädigung von Neuronen im Vergleich zu den üblichen 250-350 um Scheiben für Hirngewebe .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Wir haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Neurobasal-A Medium (benutzerdefiniert) | Invitrogen | 0050128DJ | kundenspezifische Herstellung glukosefrei |
| Hibernate-A Medium (benutzerdefiniert) | BrainBits | kundenspezifische glukosefreie | |
| Penicillin-Streptomycin (20.000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | andere Hersteller akzeptabel |
| Stericup Vakuumfiltereinheiten (0,22 μ m) | Millipore | andere Hersteller akzeptabel | |
| 25 mm Glasdeckgläser | Warner | #1 25mm rund | |
| 18 mm Glasdeckgläser | Warner | #1 18mm rund | |
| GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
| B27 minus Insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
| Rasierklinge | VWR | 55411 | |
| Vibratome & Kühlkammer | Vibratome | Series 1000 Trennsystem | |
| Vibratome Klingen | Polysciences | 22370 | Injektor oder Doppelklingen anderer Hersteller akzeptabel |
| Papain, Suspension | Worthington | LS003124 | |
| BSA, geeignet für Zellkultur | Sigma | anderer Hersteller akzeptabel | |
| DNAse, für Zellkultur | Invitrogen | anderen Anbietern akzeptierte | |
| Klonierungszylinder, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
| Membrane Potential Dye (blau) | Molecular Devices | R8042 | |
| Inline-Heizung | Warner | SF-28 | |
| Spritzenpumpen | WPI | sp100i | andere Hersteller akzeptabel |
| Geschlossene Kammer | Warner | RC-43C | |
| Polyethylen-Schlauch | Warner | PE-90 | |
| Metamorph | Molecular Devices | alternative Bildanalysesoftware akzeptabel | |
| Mikroskop | Olympus | BX61 WI | verwendet mit 10X objektiv |
| Kamera | Photometrie | Cool Snap HQ | |
| Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
| Beleuchtungssystem | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
Referenzen
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant? Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
- Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs gluc....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
