Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

Peeyush Kumar T.; Anju Vasudevan

doi:10.3791/51021

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Methodenartikel

Isolierung und Kultivierung von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn

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DOI:

10.3791/51021

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23. Januar 2014

Peeyush Kumar T.¹^,² , Anju Vasudevan¹^,²

¹Department of Psychiatry, Harvard Medical School, ²Angiogenesis and Brain Development Laboratory, Division of Basic Neuroscience, McLean Hospital

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Video zeigt eine einfache und zuverlässige Strategie zur Herstellung von Reinkulturen von Endothelzellen aus dem embryonalen Vorderhirn innerhalb von 10-12 Tagen und wird nützlich für die Forschung über viele Aspekte der Gehirn Angiogenese konzentriert sein.

Zusammenfassung

Embryonale Endothelzellen des Gehirns kann als ein wichtiges Werkzeug für die Untersuchung der Angiogenese und neurovaskulären Entwicklung und Wechselwirkungen dienen. Die beiden Gefäßnetze der embryonalen Vorderhirn, Pia und periventrikuläre, räumlich markante und haben unterschiedliche Ursprünge und Wachstumsmuster. Endothelzellen aus der Pia-und periventrikuläre Gefäßnetze haben einzigartige Genexpressionsprofilen und Funktionen. Hier präsentieren wir Ihnen eine Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Isolierung, Kultur, und die Überprüfung der reine Populationen von Endothelzellen aus der periventrikulären Gefäßnetz (PVECs) der embryonalen Vorderhirn (Telencephalon). In diesem Ansatz wird Telen ohne Pia Membran aus embryonalen Tag 15 Mäusen zerkleinert, mit Collagenase / Dispase verdaut und mechanisch in eine Einzelzellsuspension dispergiert. PVECs werden aus Zellsuspension mit positiven Selektion mit anti-CD-31/PECAM-1 Antikörper MicroBeads konjugiert mit einem starken Magnet gereinigtTrennverfahren. Gereinigte Zellen auf Kollagen 1 beschichtet Kulturschalen in endothelialen Zellkulturmedium kultiviert, bis sie konfluent und weitere Subkultur geworden. PVECs erhalten mit diesem Protokoll Ausstellung mit Kopfsteinpflaster und spindelförmigen Phänotypen, wie Phasenkontrast-Lichtmikroskopie und Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht. Die Reinheit der Kulturen wurde mit PVEC Endothelzellmarker etabliert. In unseren Händen, diese Methode zuverlässig und konsequent ergibt reine Populationen PVECs. Dieses Protokoll wird mechanistische Studien an gewinnen Einblicke in Vorderhirn Angiogenese, Verständnis PVEC Wechselwirkungen und Quer Gespräche mit neuronalen Zelltypen und hält ein enormes Potenzial für therapeutische Angiogenese gerichtet profitieren.

Einleitung

Angiogenese, Neurogenese und neuronale Migration sind kritische Ereignisse im zentralen Nervensystem (ZNS), Entwicklung, Reparatur und Regeneration. Mehrere elegant Studien haben gezeigt, dass Endothelzellen neuronalen Proliferation und umgekehrt stimulieren durch Freisetzung von löslichen Faktoren und durch direkten Kontakt. Wir fanden es merkwürdig, dass in der Mehrzahl dieser Studien ^1-3, während die neuronalen Vorläuferzellen / neuralen Stammzellen aus dem embryonalen Gehirn isoliert, sie sind mit Endothel-Zellen aus dem erwachsenen Gehirn, andere erwachsene Gewebequellen oder mit einer endothelialen Zelllinien kokultiviert. Dies kann zum Teil aufgrund....