Imaging dendritischen Dornen von Rat Primär Hippocampus Neuronen mit Structured Illumination Microscopy

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen von Neuronen im Hippocampus in vitro unter Verwendung Structured Illumination Microscopy (SIM). Super-Resolution-Mikroskopie mit SIM bietet Bildauflösung deutlich über der Lichtbeugungsgrenze in allen drei Raumdimensionen, so dass die Abbildung der einzelnen dendritischen Dornen mit verbesserten Details.

Zusammenfassung

Dendriten sind Vorsprünge, die aus der Dendriten eines Neurons und stellen die primären Ziele von exzitatorischen postsynaptischen Eingänge im Gehirn. Technologische Fortschritte haben diese Strukturen als Schlüsselelemente in Neuron-Konnektivität und synaptische Plastizität identifiziert. Die quantitative Analyse der Wirbelsäule Morphologie mittels Lichtmikroskopie bleibt ein wesentliches Problem aufgrund technischer Einschränkungen mit intrinsischer Brechungsgrenze Lichts verbunden. Dendritischen Dornen können leicht durch konfokale Laser-Scanning-Fluoreszenz-Mikroskopie identifiziert werden. , Mess subtile Veränderungen in der Form und Größe der Stacheln ist jedoch schwierig, weil andere ist als die Länge der Wirbelsäule Dimensionen sind in der Regel kleiner als herkömmliche theoretische Auflösungsgrenze von 200 nm Lichtmikroskopie fixiert optische Auflösung.

Mehrere neu entwickelten Super-Resolution-Techniken, um Bild zellulären Strukturen kleiner als die 200 nm, einschließlich dendritischen Dornen verwendet. Tiese Techniken basieren auf klassischen Fernfeld-Operationen auf der Grundlage und ermöglichen die Nutzung der vorhandenen Probenvorbereitung und Bild über die Oberfläche einer Probe. Beschrieben wird hier ein Arbeitsprotokoll zum Super Resolution Structured Illumination Microscopy (SIM), um die Abbildung von dendritischen Dornen in primären hippokampalen Neuronenkulturen gelten. Mögliche Anwendungen der SIM schneiden sich mit denen der konfokalen Mikroskopie. Allerdings präsentieren sich die beiden unterschiedlichen Techniken Anwendbarkeit. SIM bietet eine höhere effektive laterale Auflösung, während der konfokalen Mikroskopie, die auf die Benutzung eines physischen Lochkamera, erreicht Verbesserung der Auflösung auf Kosten der Beseitigung der aus der Fokus Licht. In diesem Protokoll werden die primären Neuronen auf Deckgläschen mit einem Standard-Protokoll, mit DNA-Plasmiden, die fluoreszierende Proteine ​​und abgebildet mit SIM transfiziert, kultiviert. Die hierin beschriebene gesamte Protokoll dauert ca. 2 Wochen, da dendritischen Dornen abgebildet werden nach 16-17 Tagen in vitro, wenndendritischen Entwicklung optimal ist. Nach Beendigung des Protokolls kann dendritischen Dornen in 3D aus der Serie von SIM-Bildstapeln mit spezieller Software rekonstruiert werden.

Einleitung

Ein dendritisches Wirbelsäule ist ein kleiner Vorsprung des Neurons Membran. Diese charakteristische Struktur ist darauf spezialisiert, in der Regel erhalten Input von einer einzigen Synapse und stellt die physikalische Kontaktfläche zwischen zwei Nervenzellen. Die meisten funktionell reifen dendritischen Dornen bestehen aus einem kugelförmigen Spitze, genannt Kopf und einem dünnen Hals, der den Kopf mit dem dendritischen Welle verbindet. Allerdings sind nicht statisch, Stacheln und aktiv zu bewegen und ändern ihre Morphologie kontinuierlich auch im erwachsenen Gehirn ^2. In einem 2-wöchigen Zeitraum, Ratte primären Hippocampus-Neuronen-Kulturen vom späten ....

Protokoll

Alle Experimente mit Tieren wurden optimiert, um das Leiden der Tiere zu verringern und wurden von der Kommission für Tierversuche, Universität Amsterdam, DEC-Protokoll # DED204 und DED250 genehmigt.

1. Coverslip Vorbereitung

1. Reduzieren Sie die Deckgläser zu einer Größe von 15 mm x 15 mm mit einem Hartmetall-oder Diamant-Schreiber, so dass sie in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte passen.
2. Während der Arbeit in einem Abzug beginnen Deckbeschichtung durch Untertauchen vollDeckGläser in konzentrierter Salpetersäure-Lösung (70% w / w) in einem Glasbehälter. Um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten schütteln, da....

Ergebnisse

Beschrieben wird hier eine standardisierte Arbeitsprotokoll zur Abbildung dendritischen Dornen aus Ratten primäre Neuronen im Hippocampus in vitro mit SIM-Karte. Der Protokollablauf sowie die wesentlichen Schritte sind in Abbildung 1 dargestellt. Insgesamt dauert das Protokoll etwa 2 Wochen nach der experimentellen Arbeit in einer ersten Phase der Probenvorbereitung, einschließlich Kultur, Entwicklung und Transfektion von primären Ratten-Hippocampus-Neuronen und Immunhistochemie getrennt, und d.......

Diskussion

In diesem Artikel wird ein Arbeitsprotokoll, um Bild dendritischen Dornen aus Ratten-Hippocampus-Neuronen primäre Verwendung der SIM in vitro beschrieben. Der primäre Hippocampus Kultur-Methode ist eine Anpassung der von Kaech und Banker ¹⁸ beschrieben ursprünglichen Methode. Die Hauptunterschiede sind die Verwendung von Neurobasal/B27 Kulturmedium, das das Erfordernis der Zuführung Astroglia Kulturen eliminiert, und die Zugabe des mitotischen Inhibitor FUDR an Tag 3, der das Überleben von Neuronen f.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Feine Pinzette
Große Pinzette
Feine Schere
Große Schere
Stumpfer Spatel
Präpariermikroskop mit Beleuchtung
Lichtmikroskop
37 & Deg; C Wasserbad
Laminar-Flow-Zellkulturhaube
Hochtemperatur-Trockenofen
Bunsenbrenner
Zellkultur-Inkubator (5% CO2, 37 &de; C)
Mikrozentrifuge
Orbital Shaker
[header]
Nikon Mikroskop mit strukturierter Beleuchtung, bestehend aus:
Nikon Eclipse Ti Research Inverses Mikroskop mit Perfect Focus System
Nikon CFI Apo TIRF 100x Ölobjektiv (N.A. 1.49)
4 Kohärente Saphirlaser (458, 488, 514 und 561 nm Austrittswellenlänge)
SIM Illuminator
Nikon Stage Controller
MCL Nano-Drive Piezo Controller
Nikon Intensilight C-HGFIE Quecksilberlampe
SIM Mikroskop Gehäusetemperaturregelung
Andor EM-CCD Kamera iXon DU897
PC mit Microsoft Windows 7 Home Edition
Nikon' s NiS Elements 6.14 SIM Softwarepaket
Nikon Typ A Immersionsöl