على الورق اللونية الكشف عن<em> كولاي</em>،<em> السالمونيلا</em> النيابة، و<em> المستوحدة الليستيريا</em> من كميات كبيرة من المياه الزراعية
Summary
A protocol involving integrated concentration, enrichment, and end-point colorimetric detection of foodborne pathogens in large volumes of agricultural water is presented here. Water is filtered through Modified Moore Swabs (MMS), enriched with selective or non-selective media, and detection is performed using paper-based analytical devices (µPAD) imbedded with bacterial-indicative colorimetric substrates.
Abstract
يصف هذا البروتوكول الكشف اللونية السريع للالقولونية، السالمونيلا، والليستيريا المستوحدة كميات كبيرة من (10 لتر) من المياه الزراعية. هنا، يتم تصفية المياه من خلال التعديل العقيمة مور مسحات (MMS)، والتي تتكون من مرشح الشاش بسيطة المغلقة في خرطوشة من البلاستيك، لتركيز البكتيريا. بعد الترشيح، يتم تنفيذ التخصيب غير انتقائية أو انتقائية للبكتيريا المستهدفة في MMS. للكشف اللونية من البكتيريا المستهدفة، ثم يتم يعاير التخصيب باستخدام الورقية الأجهزة التحليلية (μPADs) جزءا لا يتجزأ مع البكتيريا الإرشادية ركائز. كل الركيزة يتفاعل مع الانزيمات البكتيرية الهدف الإرشادي، وتوليد المنتجات الملونة التي يمكن أن يتم الكشف عن البصر (الكشف النوعي) على μPAD. بدلا من ذلك، يمكن أن تتولد الصور الرقمية من μPADs تفاعلت مع المسح المشترك أو أجهزة التصوير وتحليلها باستخدام برنامج ImageJ، آلخوار لمزيد من التفسير الموضوعي وموحدة من النتائج. على الرغم من أن تصميم إجراءات الفرز البيوكيميائية لتحديد مسببات الأمراض البكتيرية المذكورة آنفا، في بعض الحالات تنتج الأنزيمات التي كتبها مجهريات البقعة الخلفية أو تدهور ركائز اللونية قد تنتج إيجابية كاذبة. وبالتالي، هناك حاجة إلى تأكيد التشخيص باستخدام أكثر التمييزية. ومع ذلك، وهذا التركيز والكشف عن منصة البكتيرية غير مكلفة وحساسة (0.1 كفو / مل حد الكشف)، من السهل القيام بها، والسريع (يتم تنفيذ التركيز، والإثراء، والكشف غضون ما يقرب من 24 ساعة)، لتبرير استخدامه كطريقة الفحص الأولي لجودة الميكروبيولوجية للمياه الزراعية.
Introduction
من المهم أن يتم الكشف عن الأمراض المنقولة بالأغذية وكلاء بسرعة ويفضل في إعدادات ميدانية من أجل الحد من عبء الأمراض المنقولة بالأغذية. وتشمل استراتيجيات مشتركة للكشف عن مسببات الأمراض البكتيرية المنقولة عن طريق الأغذية التنميط الكيمياء الحيوية، وزراعة انتقائية والتفضيلية، والعزلة المناعية والكشف، والكشف الجزيئي. غير أن ما يعرقل هذه الأساليب التي تلوث متفرقة، وأحجام عينة صغيرة اختبارها، وتركيزات منخفضة في كثير من الأحيان من البكتيريا المسببة للأمراض المنقولة عن طريق الأغذية، تتطلب أوقات المعالجة طويلة، و / أو غير قابلة للتطبيق لإعدادات المجال. علاوة على ذلك، في كثير من المركبات المصفوفات الغذائية المثبطة لكشف والتطبيقات التشخيصية. من أجل تحسين احتمالات الكشف عن الجراثيم، واقترحت إدارة الأغذية والأدوية الأمريكية أن اختبار المياه الزراعية (مثل مياه الغسيل ومياه الري) التي إما يأتي في اتصال مع مساحة كبيرة من المنتجات الطازجة أو بمثابة وسيلة لعتلوث roduce هو بديل قابل للتطبيق لاختبار مباشرة من المواد الغذائية 1. وحتى مع ذلك، وغالبا ما تكون منخفضة الطبيعية الممرض الأعباء إلى جانب تأثير التخفيف من عينة تمثيلية المياه الزراعية يجعل طرق إعداد العينات للتركيز الممرض الأساسية. ان مثل هذه الطريقة تتطلب أخذ العينات كميات كبيرة من المياه (≥ 10 L)، كافية الممرض على التركيز، والتوافق مع استراتيجيات الكشف المصب.
مسحات مور تعديل (MMS) هي أجهزة غير مكلفة وبسيطة، وعرة تستخدم لتركيز البكتيريا من كميات كبيرة (≥ 10 لتر) من الماء 2-4. يتكون MMS من شريط من البلاستيك مليئة الشاش، والتي هي بمثابة فلتر الخشنة لكميات كبيرة من المياه التي يتم ضخها من خلال الكاسيت باستخدام مضخة تحوي. رسائل الوسائط المتعددة هي طريقة غير التمييزي لتركيز البكتيريا (≥ تركيز 10 أضعاف) الذي يلتقط المواد العضوية وغير العضوية الجسيمات بما في ذلك الكائنات الحية الدقيقة في معالجة لىعينات مضغة. فمن المرجح أن فعالية ممتازة للتركيز الكائنات الدقيقة المستهدفة من قبل MMS يمكن تفسير حقيقة أن من المتوقع أن تعلق على جزء الطمي أو الطين العضوية المجاميع الصغيرة من المواد الصلبة العالقة 3 الكائنات الحية الدقيقة. تصميم وعرة للMMS يسمح للتغلب على أوجه القصور المرتبطة معظم طرق الترشيح الأخرى لالتقاط وتركيز البكتيريا من المياه، مثل انسداد المرشحات، وعدم القدرة على معالجة كميات كبيرة، وعينات فلتر مع العكارة العالية، وارتفاع التكاليف. لهذه الأسباب، وادارة الاغذية والعقاقير توصي بإدراج لMMS في الإجراءات الرسمية لإجراءات جمع العينات البيئية والمتعلقة تنتج-5.
هنا، يتم وصف طريقة لتركيز، والإثراء، والكشف عن الإشريكية القولونية، السالمونيلا، والليستيريا المستوحدة من المياه الزراعية. ويستخدم MMS للتركيز جرثومةeria، وأيضا بمثابة سفينة لتخصيب البكتيرية انتقائية أو غير انتقائية. ويتحقق كشف البكتيريا كيميائيا باستخدام الورقية الأجهزة التحليلية (μPADs) 6. يمكن تصنيعها μPADs كشبكات فلويديك أو اختبارات البقعة باستخدام مجموعة متنوعة من الأساليب بما في ذلك ضوئيه والطباعة النافثة للحبر، وختم، والشمع الطباعة 7-11. يمكن أمثلة من التصاميم فلويديك تكون أنماط قناة شجيري حيث يترسب العينة في الوسط وبعد ذلك يتدفق إلى الخزانات البعيدة أو أنماط قناة واحدة التي يتم فيها سحب العينة أو الركيزة من الخزانات الخارجية للقناة عن طريق عمل شعري في مركز 12. لهذا البروتوكول، الذي اخترناه لتوظيف لمدة 7 ملم قطرها الشمع ورقة صفائف بقعة جعلهما مع ركائز مولد اللون التي يمكن معالجتها بواسطة الأنزيمات يدل على الكائنات الحية الدقيقة اختبار هنا: الكلورية الحمراء β-D-galactopyranoside (CPRG) و 5 – برومو كلورو-4-3-indolyl β-D-غلوكورونيد (X-الحلاوة)للكشف عن β-غالاكتوزيداز وβ غلوكورونيداز التي تنتجها E. القولونية؛ كابريلات 5 برومو كلورو 6-3-indolyl (أرجواني كابريلات) للكشف عن C8-استريز التي تنتجها السالمونيلا.؛ و5-برومو-4-كلورو-3-indolyl-ميو اينوزيتول الفوسفات (X-الشرطة الوطنية العراقية) للكشف عن فوسفتيدلينوستول محددة فسفوليباز C (PI-PLC) التي تنتجها L. المستوحدة 6. وبالتالي، فإن وجود بكتيريا خاصة يمكن ملاحظتها بصريا دون الحاجة إلى معدات معقدة أو تفسير البيانات. خصوصية وحساسية اللونية الكشف μPAD القائم على إنزيم من هذه البكتيريا هدف محدد قد تم استكشافه من قبل 6. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم حساسية طريقة الكشف عن تركيز متكاملة لهذه البكتيريا المستهدفة من قبل ارتفاعه كميات كبيرة من الماء مع المستويات المحددة مسبقا من الكائنات الحية الدقيقة (بيانات غير منشورة وبيشة وآخرون 13).
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وسيلة متكاملة للكشف عن E. القولونية، السالمونيلا، وL. المستوحدة في المياه الزراعية. هنا، وتركيز MMS البكتيريا كميات كبيرة من (10 لتر) من المياه للأغراض الزراعية، ويقترن مع تخصيب البكتيرية، والكشف اللونية بكتيريا الإرشادية باستخدام μPADs. الإجراء MM…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We gratefully acknowledge funding for this project from the USDA National Institute of Food and Agriculture grants 2009-01208 and 2009-01984.
Materials
| Agricultural water | Irrigation water, produce wash water, well water, etc. | ||
| Vinyl tubing | Wilmar | BN-CVT1005 | 1/4" inner diameter, 3/8" outer diameter, available at: http://www.wilmar.com |
| Modified Moore Swab cartridge | Lumiere Diagnostics | 11 ½ cm in length and 4 ½ cm in width, available at: http://www.lumierediagnostics.com. Alternativelly, a non-disposable version of the cartridge can be used (refer to the text) | |
| Cheesecloth | Chesapeake Wiper & Supply, Inc. | CC90 | Grade #90, 44 × 36 weave, available at: www.raglady.com |
| Household Bleach | Various | Sodium hypochlorite concentration approx. 6% | |
| Sodium thiosulphate 5-hydrate | Mallinckrodt Baker Inc | 8100-04 | |
| Manifold | Built in-house | Optional, device can be constructed from PVC pipes and appropriate fittings | |
| Peristaltic pump | Micron Meters | RPP1300 | Available at: http://www.micronmeters.com |
| Serological pipette | Various | Disposable, 10ml | |
| Universal preenrichment broth | Difco | 223510 | |
| Buffered peptone water | Difco | 218105 | |
| Salmonella supplement | Biomérieux Industry | 42650 | http://www.biomerieux-usa.com |
| VIDAS UP Listeria (LPT) Broth | Biomérieux Industry | 410848 | http://www.biomerieux-usa.com |
| Vancomycin | Sigma-Aldrich | 861987 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Pipet-Aid | Various | Drummond DP-110 used here | |
| Shaking incubator | Various | Excella E25, New Brunswick Scientific used here | |
| Micropipette | Various | 10 μl, 1 ml | |
| Micropipette tips | Various | Barrier, 10 μl, 1 ml | |
| 1.5 microcentrifuge tubes | Various | RNase- and DNase- free | |
| Probe sonicator | Q Sonica LLC | XL-2000 series | |
| µPADs | Avant | Wax printed 7 mm diameter circles, with 4 pt line thickness. Contact Dr. Charles Henry for additional information | |
| HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-2-ethanesulfonic acid] | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8022 | |
| Chlorophenol red-galactopyranoside (CPRG) | Sigma-Aldrich | 59767 | |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (X-Gluc) | Sigma-Aldrich | B8174 | |
| 5-bromo-6-chloro-3 indolylcaprylate (magenta caprylate) | Sigma-Aldrich | 53451 | |
| 5-Bromo-4-chloro-myo-inositol phosphate (X-InP) | Sigma-Aldrich | 38896 | |
| Petri dishes, polystyrene 100mm by 15 mm | Various | Sterile | |
| Flat bed scanner | Various | Xerox USB scanner | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | http://rsb.info.nih.gov/ij/ |
Referenzen
- . . Guidance for industry: Guide to minimize microbial food safety hazards for fresh fruits and vegetables. , (1998).
- Bisha, B., Pérez-Méndez, A., Danyluk, M. D., Goodridge, L. D. Evaluation of Modified Moore swabs and continuous flow centrifugation for concentration of Salmonella and Escherichia coli O157:H7 from large volumes of water). J Food Prot. 74, 1934-1937 (2011).
- Sbodio, A., Maeda, S., Lopez-Velasco, G., Suslow, T. V. Modified Moore swab optimization and validation in capturing E. coli O157:H7 and Salmonella enterica in large volume field samples of irrigation water. Food Res Int. 51, 654-662 (2013).
- McEgan, R., et al. Detection of Salmonella spp. from large volumes of water by modified Moore swabs and tangential flow filtration. Lett Appl Microbiol. 56, 88-94 (2013).
- . . Solicitation Number: FDA-SS-1116253. , (2013).
- Jokerst, J. C., et al. Development of a paper-based analytical device for colorimetric detection of select foodborne pathogens. Analytical Chemistry. 84, 2900-2907 (1021).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Butte, M. J., Whitesides, G. M. Patterned paper as a platform for inexpensive, low-volume, portable bioassays. Angew Chem Int Edit. 46, 1318-1320 (2007).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Wiley, B. J., Gupta, M., Whitesides, G. M. FLASH: A rapid method for prototyping paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 8, 2146-2150 (1039).
- Abe, K., Suzuki, K., Citterio, D. Inkjet-printed microfluidic multianalyte chemical sensing paper. Analytical Chemistry. 80, 6928-6934 (1021).
- Cheng, C. M., et al. Millimeter-scale contact printing of aqueous solutions using a stamp made out of paper and tape. Lab on a Chip. 10, 3201-3205 (1039).
- Lu, Y., Shi, W. W., Jiang, L., Qin, J. H., Lin, B. C. Rapid prototyping of paper-based microfluidics with wax for low-cost, portable bioassay. Electrophoresis. 30, 1497-1500 (2009).
- Charles, S., Henry, L. D. G., Jana, C. Jokerst Rapid detection of pathogens using paper devices. US patent. , (2012).
- Bisha, B., et al. T10-06 Colorimetric paper-based detection of Salmonella spp. and Escherichia coli from artificially contaminated irrigation river water. , (2012).
