Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridisierung Protokoll<em&gt; Xenopus</em

Steven J. Deimling; Rami R. Halabi; Stephanie A. Grover; Jean H. Wang; Thomas A. Drysdale

doi:10.3791/51526

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Methodenartikel

Das Verständnis frühen Organogenese das vereinfachte

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DOI:

10.3791/51526

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12. Januar 2015

Steven J. Deimling¹ , Rami R. Halabi²^,³ , Stephanie A. Grover⁴ , Jean H. Wang²^,⁵ , Thomas A. Drysdale²^,⁴^,⁵

¹Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, ²Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, ³Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, ⁴Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, ⁵Department of Paediatrics, University of Western Ontario

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Der Xenopus laevis Embryo ist aufgrund seiner Größe und Leichtigkeit der Manipulation weiterhin außerordentlich nützlich bei der Erforschung der frühen Entwicklung. Es wird ein vereinfachtes Protokoll für das Whole Mount in situ Hybridisierungsprotokoll zur Verfügung gestellt, das bei der Identifizierung spezifischer Organe in diesem Modellsystem verwendet werden kann.

Zusammenfassung

Organogenese ist die Untersuchung, wie Organe spezifiziert werden und dann während der Entwicklung ihre spezifische Form und Funktion erhalten. Der Xenopuslaevis-Embryo ist sehr nützlich für die Untersuchung der Organogenese, da er aufgrund seiner Größe sehr gut für die Identifizierung von Organen in den frühesten Schritten der Organogenese geeignet ist. Zu diesem Zeitpunkt ist die primäre Methode, die zur Identifizierung eines spezifischen Organs oder Primordiums verwendet wird, die Whole-Mount-in-situ-Hybridisierung mit markierten Antisense-RNA-Sonden, die spezifisch für ein Gen sind, das in dem interessierenden Organ exprimiert wird. Darüber hinaus ist es relativ einfach, Gene oder Signalwege in Xenopus zu manipulieren, und die In-situ-Hybridisierung ermöglicht es dann, auf Veränderungen im Vorhandensein oder in der Morphologie eines Zielorgans zu testen. Die In-situ-Hybridisierung des gesamten Mount ist ein mehrtägiges Protokoll mit vielen Schritten. Hier bieten wir ein vereinfachtes Protokoll mit reduzierter Anzahl von Schritten und verwendeten Reagenzien, das sich gut für Routine-Assays eignet. In-situ-Hybridisierungsroboter haben den Prozess erheblich vereinfacht, und wir beschreiben, wie und wann wir diese Technologie in diesem Prozess einsetzen. Sobald eine In-situ-Hybridisierung abgeschlossen ist, kann es frustrierend sein, das beste Bild des Ergebnisses aufzunehmen. Wir beraten Sie, wie die Bildgebung von In-situ-Hybridisierungsergebnissen optimiert werden kann. Obwohl das Protokoll die Beurteilung der Organogenese bei Xenopus laevis beschreibt, kann das gleiche Basisprotokoll mit ziemlicher Sicherheit auf Xenopus tropicalis und andere Modellsysteme übertragen werden.

Einleitung

Das Expressionsmuster eines bestimmten Gens ist eine wichtige Information bei der Bestimmung der potenziellen Rolle dieses Gens bei der Entwicklung eines bestimmten Organs oder Zelltyps. Einfach ausgedrückt: Wenn sie nicht zur richtigen Zeit und am richtigen Ort geäußert wird, ist es unwahrscheinlich, dass sie eine Schlüsselrolle spielt. Bei Xenopus, wie bei den meisten frühen Embryonen, ist der am häufigsten verwendete Assay zum Nachweis der Expression eines Gens die In-situ-Hybridisierung mit markierten Antisense-RNA-Sonden. Die Verwendung von Antikörperfärbung zur Beurteilung der Expression eines Gens in Xenopus wird immer häufiger, d....