Dieses Protokoll beschreibt den qPCR-Nachweis von Cytomegalievirus in formalinfixiertem, in Paraffin eingebettetem Biopsiegewebe, der schnell, sensitiv, spezifisch und nützlich für die Interpretation von mehrdeutigen Hämatoxylin- und Eosin- oder immunhistochemischen Färbemustern ist.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
qPCR ist eine empfindliche und schnelle Methode zur Detektion von DNA Zytomegalieviren in Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebebiopsie
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Es ist entscheidend, Cytomegalovirus (CMV)-Infektion im Magen-Darm-Trakt (GI) bei immunsupprimierten Patienten zu identifizieren, aufgrund ihrer höheren Risiko für schwere Infektionen. Viele Laborverfahren zum Nachweis von CMV Infektion entwickelt worden, einschließlich der Serologie, Viruskultur und molekularbiologischer Methoden. Oft sind diese Methoden reflektieren systemische Beteiligung mit CMV und nicht spezifisch lokale Gewebe Beteiligung zu identifizieren. Daher wird der Nachweis von CMV Infektion in den GI-Trakt häufig durch herkömmliche Histologie der Biopsiegewebe gemacht. Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Färbung in Verbindung mit der Immunhistochemie (IHC) haben die Hauptstützen der Untersuchung dieser Biopsien geblieben. H & E und IHC manchmal in atypischen (zweideutig) Färbungsmuster führen, was die Interpretation erschweren. Es wurde gezeigt, dass quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zur CMV erfolgreich auf Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebebiopsie durchgeführt werden, für sehrhohe Sensitivität und Spezifität. Das Ziel des Protokolls ist es, zu demonstrieren, wie qPCR Tests für den Nachweis von CMV in FFPE Biopsiegewebe in einer klinischen Laborumgebung durchzuführen. Diese Methode ist wahrscheinlich von großem Nutzen für die Patienten in Fällen von zweideutigen Färbung für CMV in GI Biopsien sein.
Einleitung
Interpretation von Cytomegalovirus (CMV)-Infektion in klinischen Proben ist von entscheidender Bedeutung. CMV ist ein Mitglied der Unterfamilie Betaherpesvirinae von Herpesviren. Ähnlich wie bei anderen Herpesviren, hat die Fähigkeit, CMV dauerhafte oder latente Infektion zu etablieren, gekennzeichnet durch einen Mangel der aktiven Virusreplikation 1. Reaktivierung des Virus kann in Zeiten von Stress oder andere Immunsuppression auftreten, was zu aktiver Virusreplikation, gekennzeichnet durch Virion Mitteilung, die von Krankheitsmanifestationen 2-4 begleitet sein kann. Gastrointestinale (GI) CMV-Erkrankung Symptome sind häufig Bauchschmerzen und....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
Mit der Zustimmung des Institutional Review Board wurde eine Suche des elektronischen Labor-Datenbank durchgeführt, um in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Blöcken, die Fälle von Cytomegalovirus (CMV)-Infektion bei gastrointestinalen (GI) Biopsien durch Histopathologie diagnostiziert (Hämatoxylin und identifizieren Eosin (H & E) und / oder Immunhistochemie (IHC)).
1. Gewebeverarbeitung aus FFPE GI Biopsie Gewebe
- FFPE GI Biopsie Gewebeblöcke Sammeln für Cytomegalovirus (CMV) quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR). Diese Blöcke werden bei Raumtemperatur gelagert.
- Pre-Etikett 1,7 ml Mikrozent....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
Ein insgesamt 228 Gewebeblöcke wurden durch quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR), die von 91 Cytomegalovirus (CMV)-positiven Fällen mit zweideutigen CMV IHC bestand, wurde basierend auf positive Histologie und Immunhistochemie (IHC), 18, und 79 negative Kontrollen getestet. Wie in Abbildung 2 dargestellt, würde CMV-positiven Fällen typische CMV Viruseinschlüsse (A) und / oder positive IHC-Färbung (B) gezeigt haben. Nicht eindeutige Fälle würden seltenen, nicht-.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Viele Labormethoden sind für die Diagnose des Cytomegalovirus (CMV)-Infektion, darunter Serologie, Viruskultur, Molekularbiologie Virämie Assays, Histologie von Biopsiematerial und, wie kürzlich gezeigt, molekulare Tests von Formalin-fixierte, in Paraffin eingebetteten (FFPE) Biopsie verfügbar Gewebe 5,6. Serologie, einst eine tragende Säule der Diagnose, nur zuverlässig identifiziert Belichtung und nicht gut mit akuten CMV-Infektion 7 korrelieren. Viruskultur, sowohl konventionelle als frühe Antig.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir erkennen an, Amy Thomasson für ihre Unterstützung bei der Vorbereitung dieses Manuskript, und Fredrik Skarstedt und Ryan Christy für ihre Bemühungen bei der Vorbereitung der Zahlen.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1,7 ml Mikrofugenröhrchen | Costar | 3620 | |
| Zange mit Wellenschliff | Elektronenmikroskopie Dienstleistungen | 62086-1S | Mikropinzette MF-1 |
| Tischzentrifugen (Mikrofuge) | Eppendorf | 5424 | |
| Xylol | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 Gallone |
| Ethanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Mikrotom | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| CMV LC PCR Supplement Kit | Qiagen | 1031873 | |
| LightCycler Zentrifuge | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Kühlblock | Roche | ||
| LightCycler Verschließwerkzeug | Roche | 3357317 | |
| Farbkompensationskit | Roche | 2158850 | |
| LightCycler 20 μ l Kapillaren | Roche | 1 909 339 | |
| Klingen | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge niedriges Profil |
Referenzen
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
