The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.
Den zebra finke (Taeniopygia guttata) er blevet en stadig vigtigere model organisme i mange forskningsområder, herunder toksikologi 1, 2, adfærd 3 og hukommelse og indlæring 4,5,6. Som den eneste sangfugl med et genom, zebraen finke har et stort potentiale til brug i udviklingsmæssige undersøgelser; Men de tidlige stadier af zebra finke udvikling er ikke blevet godt undersøgt. Manglende forskning i zebra finke udvikling kan henføres til vanskeligheden ved at dissekere den lille æg og foster. Den følgende dissektion metode minimerer embryonale vævsskader, som giver mulighed for undersøgelse af morfologi og genekspression på alle stadier af fosterudviklingen. Dette tillader både lyse felt og fluorescens kvalitet billeddannelse af embryoner, anvendes i molekylær procedurer såsom in situ hybridisering (ISH), celleproliferationsassays, og RNA ekstraktion for kvantitative assays, såsom kvantitativ real-time PCR (qtRT-PCR). Denne teknik gør det muligt for efterforskerne at studere tidlige stadier af udvikling, der tidligere var vanskeligt at få adgang.
Det overordnede mål med denne teknik er at få zebra finke (Taeniopygia guttata) embryoner fra de tidligste stadier af embryogenese til brug i en bred vifte af udviklingsmæssige undersøgelser. Zebra finke er blevet den fremherskende sangfugl model organisme og er blevet brugt i udstrakt grad i en række forskellige områder, herunder toksikologi 1,2, adfærd 3, hukommelse og indlæring 4,5,6 sammenlignende neuroanatomi 7,8 og sproglig udvikling 9,10 . Som den eneste sangfugl med et genom, zebraen finke tillader molekylær og genetisk undersøgelse af Passeriformes rækkefølge, som udgør over 50% af de kendte fuglearter 11, 12,13.
Trods brug af voksne og unge zebra finke i en bred vifte af områder, har kun få undersøgelser er blevet udført på zebra finke embryoner, især i de tidlige stadier af udvikling. Dette kan henføres til den lille størrelse af deres æg ennd embryoner, og deres nyere status som en model organisme 14,15,16 for undersøgelser, hvor kyllingen (Gallus gallus domesticus), der tidligere blev brugt som en fremherskende model-system 17,18,19,20,21. Men som ikke-vokale elever, kyllinger er ikke en passende model for at studere det genetiske grundlag for vokal læring, udvikling af vokal læring, arvelighed, adfærd og kortikale-basalganglierne kredsløb involveret i motorisk læring 10..
Det er vigtigt at bemærke, at zebra finke embryoner er langt mere delikat og lettere beskadiget end kyllingeembryoer under dissektion og molekylære procedurer. Især er større omhu, der kræves, når der udføres permeabilisering trin på zebra finke embryoner. Stærke rengøringsmidler og enzymer, som ikke ville skade en kyllingeembryo kan skade zebra finke embryoner. Med hensyn til pleje, er det nødvendigt at sætte zebra finke æg i små kopper før placering i en inkubatorat forhindre dem i at bryde, når rullende under inkubation.
Zebra finke er modtagelig for adfærdsmæssige undersøgelser, nemt og frodigst avle året rundt i fangenskab, og er vokal lærende. Disse egenskaber tillader brug af zebra finke at imødekomme behovet for en model organisme, der integrerer udvikling, genetik og adfærdsmæssige aspekter af sproget. De dissektioner metoder er nærmere beskrevet nedenfor, kombineret med et nyudviklet iscenesættelse guide specifikt til zebra finke 22, gør zebra finke en stadig nyttigt standardiseret udviklingsmæssige model organisme. Dog kan opnå embryoner i de tidlige stadier være skræmmende. Protokollen giver efterforskerne at nemt få embryoer tidligt. Studier, der undersøger den tidlige udvikling og den molekylære udviklingsmæssige basis af komplekse adfærd i zebra finke, eller de toksikologiske virkninger på udviklingen i andre lille, vil spurvefugle finde denne dissektion metode nyttig.
Seneste udvikling af en embryologiske iscenesættelse guide 22 og genom annotation gør zebra finke en ønskelig model organisme til udviklingsmæssige undersøgelser. Den lille størrelse og skrøbelighed af zebra finke embryoner, der spænder fra 3 til 7 mm i etaper 1, men – 10 22, kan gøre dissektioner vanskelig 11, 14. Lokalisering og rent fjerne embryoner fra overfladen af blommen kan være udfordrende. Denne protokol giver tilstrækkelige detaljer til at udføre proceduren med lethed. Denne protokol viser de vigtige skridt, der ikke er typisk kendt, men er nødvendige for at sikre en vellykket dissektion. For eksempel er det vigtigt at efterlade et lille lag af æggeblomme mellem embryonet og ark vejes papir til hinder stikning.
Både identifikation og fjernelse af fosteret kan være svært. Til fejlfinding identificere embryonet på overfladen af blommen skinne lys direkte over blommesækken, efter at den harblevet fjernet fra ægget, og se på blommen ved en 45 ° vinkel for at finde embryoet. Når fosteret er placeret, skære blommen på veje papir idet man ikke rive embryoet.
Hvis yderligere ansøgninger omfatter billeddannelse til anatomiske forskelle, in situ hybridisering, eller celleproliferationsassays, er det vigtigt at fjerne vitellinmembranen i trin 1 – 8 22 for bedre visualisering af strukturer. Hvis oplever problemer, når du fjerner æggeblomme eller vitellinmembranen i tidlige stadier, fastsætte fosteret i 4% PFA før vask det i 1X PBS for at reducere embryonale skrøbelighed. Ved først at fjerne vitellinmembranen under dissektion som beskrevet strukturer er klart synlig og intakt i zebra finke embryoner efter udførelse af en in situ-hybridisering.
En begrænsning af Edu er, at administrationen af dosering mængder gennem 478 nl fører til embryonale dødelighed. Men det store dosisskala tillader varying niveauer af proliferativ celle tagging.
"Klik" reaktion, der anvendes i dette sæt, er kobber (I)-katalyseret-Alkyn-azid-Cycloaddition (Cu (I) AAC). I denne konkrete reaktion er en alkyn-holdigt thymidinanalogen molekyle (EDU) inkorporeret ved aktivt delende celler. Den alkyngruppe i edu rager frem fra den spiralformede struktur af DNA, og detekteres ved udsættelse for et azid molekyle konjugeret til et grønt, fluorescerende molekyle, som binder til den frie alkyngruppe. Den grønne fluorescens viser de nyligt prolifererende celler i embryonet. Bio-ortogonalitet af azidet og alkyn grupper forhindrer uspecifik farvning, fordi disse reaktive arter, der ikke er naturligt til stede i organismer. Også, fordi DNA ikke behøver at blive denatureret, for at reaktionen forekommer, kan yderligere DNA-afhængig analyse være let udføres 27.
En iboende begrænsning ved denne metode er den lille størrelse og fragility af zebra finke embryoner. Fjernelse vitellinmembranen af embryoner stages 1 – 15 22 kan resultere i skadelige embryonale strukturer, hvis ikke udført med forsigtighed. Men denne protokol forenkler dissektionsmetode, så efterforskerne at benytte tidlige embryonale stadier at undersøge strukturelle anomalier og genekspression, der ikke tidligere er blevet undersøgt i dybden. Denne protokol åbner for et væld af cellulære-molekylære analyser, der vil give efterforskerne til at bestemme de udviklingsmæssige oprindelse voksne fænotyper. For eksempel vil det være muligt at undersøge genekspression impliceret i vokal læring under forskellige miljøforhold eller efter farmakologiske behandlinger på de tidligste stadier af udvikling 28, 29,30,31. Selvom det ikke er påvist i dette papir, denne metode potentielt giver mulighed for andre procedurer såsom radioaktiv in situ hybridisering på zebra finke vævssnit og elektroporation / i ovo kirurgi 32, 33,34. I betragtning af at zebra finke er blevet etableret som en vigtig model organisme i en stor mængde litteratur, sådanne undersøgelser giver uudnyttede muligheder for at linke udviklingsmæssige mekanismer med voksen fysiologi og adfærd, især udvikling af sproget 7, 9.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker deres finansieringskilder, Howard Hughes Medical Institute Undergraduate Science Education Program til College of William og Mary; Grant sponsor: NIH (MSS); Grant nummer: R15NS067566. De anerkender også støtte fra College of William og Mary, Biologisk Institut og College of Arts and Sciences for assistance med pasning af dyr.
Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
Ethanol (EtOH) | |||
50mL Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
Modeling Clay | Any brand | ||
Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20 | |||
35mL Plastic petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
plastic wrap | Any brand | ||
Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Reaction Mix: 875μL 1xPBS, 100mM 20μL CuSO4 (Kit Component E), 5μL Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100μL diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
sdd H2O | |||
Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
Stainless steel scalpel | |||
Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
4×4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |