The zebra finch (Taeniopygiaguttata) is a valuable model organism; however, early stages of zebra finch development have not been extensively studied. The protocol describes how to dissect early embryos for developmental and molecular applications.
Den sebra finch (Taeniopygia guttata) er blitt en stadig viktigere modellorganisme i mange områder av forskning inkludert toksikologi 1, 2, atferd tre, og hukommelse og læring 4,5,6. Som den eneste sangfuglen med en sekvensert genomet, har sebra finch stort potensial for bruk i utviklingsstudier; Men de tidlige stadier av sebra finch utvikling er ikke godt undersøkt. Mangel på forskning i sebra finch utviklingen kan tilskrives vanskelighetene med å dissekere den lille egg og embryo. Følgende disseksjon metoden minimerer embryonale vev skade, som gjør det mulig for etterforskningen av morfologi og genuttrykk i alle stadier av embryoutvikling. Dette tillater både lyse felt og fluorescens bildekvalitet av befruktede egg, bruk i molekylære prosedyrer som for eksempel in situ hybridisering (ISH), celleproliferasjon analyser, og RNA ekstraksjon for kvantitative analyser som kvantitativ real-time PCR (qtRT-PCR). Denne teknikken gjør det mulig for etterforskerne å studere tidlige stadier av utviklingen som tidligere var vanskelig tilgjengelig.
Det overordnede målet med denne teknikken er å skaffe sebra finch (Taeniopygia guttata) embryoer fra de tidligste stadier av embryogenesis for bruk i et bredt spekter av utviklingsstudier. Zebra Finch har blitt den dominerende songbird modellorganisme og har blitt brukt mye i en rekke felt, inkludert toksikologi 1,2, atferd 3, hukommelse og læring 4,5,6, komparativ nevroanatomi 7,8, og språkutvikling 9,10 . Som den eneste sangfuglen med en sekvensert genomet, gjør at sebra finch molekylær og genetisk studie av Passeriformes orden, som representerer over 50% av kjente fuglearter 11, 12,13.
Til tross for bruk av voksne og juvenile sebra finch i et variert utvalg av felt, har få studier utført på sebra finch embryoer, særlig i tidlige stadier av utviklingen. Dette kan tilskrives den lille størrelsen på sine egg ennd embryoer, og deres nyere status som modellorganisme 14,15,16 for studier der kylling (Gallus gallus domesticus) ble tidligere brukt som en dominerende modell system 17,18,19,20,21. Men som ikke-vokal elever, kyllinger er ikke en passende modellsystem for å studere det genetiske grunnlaget for vokal læring, utvikling av vokal læring, arvbarhet, atferd, og kortikale-basalgangliene kretser involvert i motorisk læring 10.
Det er viktig å merke seg at sebra finch embryoer er mye mer delikat og lettere skadet enn kyllingembryo under disseksjon og molekylære prosedyrer. Spesielt er større forsiktighet som kreves når du utfører permeabilization trinnene på sebra finch embryoer. Sterke vaskemidler og enzymer som ikke ville skade en chick embryo kan skade sebra finch embryoer. Når det gjelder generell omsorg, er det nødvendig å sette sebra finch egg i små kopper før plassering i en inkubatorfor å hindre dem fra å bryte når rulle under inkubasjon.
Zebra Finch er mottagelig for atferdsstudier, lett og frodig avle året i fangenskap, og er vokal elever. Disse egenskapene tillate bruk av sebra finch å ivareta behovet for en modellorganisme som integrerer utvikling, genetikk, og atferdsmessige aspekter ved språk. Disseksjonene metoder beskrevet nedenfor, kombinert med en nylig utviklet iscenesettelse guide spesifikt for sebra finch 22, gjør sebra finch en stadig mer nyttig standardisert utviklingsmodellorganisme. Men å skaffe embryoer på tidlige stadier kan være skremmende. Protokollen lar etterforskerne å lett få tidlig stadium embryoer. Studier som undersøker den tidlige utvikling og molekylær utviklings grunnlag av komplekse atferd i sebra finch, eller de toksikologiske effekter på utviklingen i andre små, vil spurvefugler finner denne disseksjon metodikk nyttig.
Nyere utvikling av en embryological iscenesettelse guide 22 og genom annotering gjør sebra finch en ønskelig modellorganisme for utviklingsstudier. Men den lille størrelsen og skjørhet av sebra finch embryo, som spenner fra 3 til 7 mm i etapper 1 – kan 10 22, gjør disseksjoner vanskelig 11, 14. Isere og rent fjerne embryoer fra overflaten av eggeplomme kan være utfordrende. Denne protokollen gir tilstrekkelig detalj for å utføre prosedyren med letthet. Denne protokollen demonstrerer de kritiske trinnene som ikke er vanligvis kjent, men er nødvendig for å sikre en vellykket disseksjon. For eksempel er det viktig å la et lite lag av eggeplomme mellom embryoet og ark av papir veie for å utelukke stikker.
Både identifikasjon og fjerning av embryo kan være vanskelig. For å løse problemer å identifisere embryoet på overflaten av eggeplomme, skinne lys direkte over plomme etter at det harblitt fjernet fra egg, og se på eggeplomme i en 45 ° vinkel for å finne embryo. Når fosteret ligger, kutte plommen på veie papir ta vare å ikke rive fosteret.
Dersom ytterligere bruksområder er tenkelig for anatomiske forskjeller, in situ hybridisering, eller celleproliferasjon assays, er det viktig å fjerne vitelline membranen i trinn 1 – 8 22 for bedre visualisering av strukturer. Hvis opplever problemer når du fjerner eggeplomme eller vitelline membran i tidlige stadier, fikse embryoet i 4% PFA før du vasker den i 1X PBS å redusere embryonale skjørhet. Ved først å fjerne vitelline membranen under disseksjon som beskrevet, strukturer er klart synlige og intakt i Sebrafink embryoer etter å ha utført en in situ-hybridisering.
En begrensning av Edu er at administrasjon av doseringsmengder enn 478 nl fører til embryonale dødsfall. Imidlertid lar det store doserings-område variasjong nivåer av proliferativ celle tagging.
"Klikk" reaksjon som brukes i dette settet er kobber (I)-katalysert-alkyne-Azid-cycloaddition (Cu (I) AAC). I denne spesifikke reaksjon, er en alkynet holdig tymidin analog molekyl (EDU) inkorporert ved aktivt delende celler. Den alkynet gruppe i edu stikker ut fra den spiralformede strukturen av DNA, og detekteres ved eksponering av en azid-molekyl konjugeres til et grønt, fluorescerende molekyl som binder seg til den frie alkynet gruppe. Den grønne fluorescens viser de nylig prolifererende celler i embryo. Den bio-ortogonalitet av azid og alkynet grupper forhindrer ikke-spesifikk farging, fordi disse reaktive arter ikke er naturlig tilstede i organismene. Også fordi DNA behøver ikke å være denaturert for at reaksjonen skal skje, kan ytterligere DNA-avhengig-analyse være lett utføres 27.
En iboende begrensning med denne metoden er den lille størrelsen og fragility av sebra finch embryoer. Fjerne vitelline membran av embryoer iscenesetter 1 – 15 22 kan føre til skadelige embryonale strukturer hvis ikke utført med forsiktighet. Men, forenkler denne protokollen disseksjon metoden, slik at etterforskerne å bruke tidlige embryonale stadier å undersøke strukturelle anomalier og genuttrykk som ikke tidligere er blitt studert i dybden. Denne protokollen åpner for en mengde cellulære-molekylære analyser som vil tillate etterforskerne å bestemme utviklings opprinnelsen til voksen fenotyper. For eksempel vil det være mulig å undersøke genuttrykk innblandet i vokal læring under ulike miljøforhold eller etter farmakologisk behandling ved de tidligste stadiene av utviklingen 28, 29,30,31. Selv om det ikke er påvist i denne papir, denne metoden potensielt åpner for andre prosedyrer som for eksempel radioaktivt i situ hybridisering på sebra finch vevssnitt og elektroporering / i ovo kirurgi 32, 33,34. Gitt at sebra finch er etablert som en viktig modellorganisme i en enorm mengde litteratur, slike studier gir uutnyttede muligheter for å knytte utviklingsmekanismer med voksen fysiologi og atferd, spesielt utviklingen av språket 7, 9.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker sine finansieringskilder, Howard Hughes Medical Institute Graduate Science Education Program til College of William and Mary; Grant sponsor: NIH (MSS); Grant Nummer: R15NS067566. De erkjenner også støtte fra College of William and Mary, Institutt for biologi og College of Arts and Sciences for å få hjelp med dyr omsorg.
Chicken egg incubator | We use a Picture Window Hova-Bator Incubator, Circulated Air Model | ||
Click-iT EdU Alexa Fluor 488 Imaging kit | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
Dissection microscope | We use Olympus SZ61 | ||
7'' Drummond capillary for Nanoject II injector | Drummond | 3-00-203-G/X | |
Drummond Nanoject II microinjector | Drummond | ||
Dumont Tweezers #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
Ethanol (EtOH) | |||
50mL Falcon tube (polypropylene) | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
FastPrep Lysis Matrix H tubes | MP biomedicals | 6917-100 | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Fiber optic illuminator lamps (High Intensity Illuminator) | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite MI-150 | |
Glass vials with screw cap (DEPC treated) | Fisher Scientific | 03-338A | |
Microcentrifuge eppe tube (1.5 mL) | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Mineral oil | Sigma-Aldrich | M-8410 | |
Modeling Clay | Any brand | ||
Narshige PB-7 needle puller | Narshige | ||
Omni Bead Ruptor Homogenizer | OMNI International | 19-010 | Used for RNA extraction |
4% Paraformaldehyde (4% PFA): 20 mL 8% PFA (32g paraformaldehyde, 350mL sdd H2O, adjust pH to 7.6, 400mL sdd H2O), 20mL 2xPBS | Fixation of embryos. Caution, is harmful and do not inhale. | ||
Phosphate buffered saline (1xPBS): 200mL 10X PBS, 1800 mL Barnstead H2O, adjust pH to 7.4 | |||
Phosphate buffered saline (10xPBS): 800mL Barnstead, 2.013g KCL, 80.063g NaCl, 2.722g KH2PO4 monobasic, 14.196g Na2HPO4 dibasic, 200mL Barnstead H2O, adjust pH to 6.5 | |||
Phosphate buffered saline with 0.1% Tween-20 (1xPTw): 1800mL Barnstead H2O, 200mL 10X PBS, adjust pH to 7.4, 2mL Tween-20 | |||
35mL Plastic petri dish | Fisher Scientific | 08-757-100A | |
plastic wrap | Any brand | ||
Prepease RNA Spin Kit | PrepEase, Affymetrix | 78766 1 KT | Used for RNA extraction, used to homogenize embryos |
Reaction Mix: 875μL 1xPBS, 100mM 20μL CuSO4 (Kit Component E), 5μL Alexa Fluor 488 azide (Kit Component B), 100μL diluted reaction buffer additive (Kit Component F) | Invitrogen | C10337 | Detection of cell proliferation. |
sdd H2O | |||
Seed cup | We use it as a container when incubating eggs | ||
Stainless steel scalpel | |||
Standard nest box | We use Abba Plastic Finch Nestboxes | ||
4mL, Teflon Lined Cap, Glass Vials | Fisher Scientific | 02-912-352 | |
Transfer pipettes (polyethylene) | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
4×4 weigh paper | Fisher Scientific | 09-898-12B |