Temel teknikler ve transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için biyolojik örneklerin ve nanomateryallerin dondurularak kırık işleme iyileştirmeler açıklanmıştır. Bu teknik ultrastrüktürel özellikleri ve biyolojik membranların uzmanlık ifşa ve malzeme bilimleri ve nanoteknoloji ürünleri ultrastrüktürel düzeyde boyutlu ve konumsal verilerin elde edilmesi için tercih edilen bir yöntemdir.
Doğada numuneler, genellikle biyolojik veya nano malzeme, kırık, dondurulmuş ve bir karbon / platin "cast" transmisyon elektron mikroskobu ile incelenmesi için tasarlanan oluşturmak için çoğaltılır sayede Freeze-kırık / donma-etch bir süreci anlatmaktadır. Örnekler sıvı azot, yüksek vakum altında sıcaklıklara soğutulan numune daha sonra kırılma ile, çoğu kez buz kristal oluşumunu sınırlamak için kriyo-koruyucu maddelerin mevcudiyetinde, ultra hızlı dondurma oranlarına tabi tutulurlar. Elde edilen kırık yüzey çoğaltılır ve döküm yüzeyi için üç boyutlu detay kazandıran bir açıdan karbon ve platinyum buharlaştırma ile stabilize edilir. Bu teknik, hücre zarlarında ve uzmanlık soruşturma için özellikle aydınlatıcı kanıtlamıştır ve ilgili hücre fonksiyonu hücresel form anlayışı önemli ölçüde katkıda bulunmuştur. Bu raporda, biz gerçekleştirmek için alet gereksinimleri ve teknik protokolünü anketdondurularak kırılmış hali olduğundan, ilgili isimlendirme ve kırılma düzlemlerinin özellikleri, donma-fraktür görüntülerin yorumlanması için geleneksel prosedür içinde yapılacak değişikliklerin ve kriterleri. Bu teknik yaygın hücre biyolojisi birçok alanda ultrastrüktürel inceleme için kullanılan ve moleküler, nanoteknoloji için gelişmekte olan bir görüntüleme tekniği olarak sözünü tutar ve malzeme bilimi çalışmaları olmuştur.
Kavramı ve biyolojik örneklerin dondurularak kırık işleme pratik uygulama bir yarım yüzyıl önce üzerinde Steere 1 tarafından tanıtıldı. Erken cihaz çalışan bir kendi kendine yeten 1 içerisinde farklı bileşenleri tahsis. Orijinal alet değiştirilmiş ve uzak manipülasyonu, yüksek vakum bakımı için kritik ihtiyacı karşılamak için, ticari olarak temin edilebilen cihazlarla rafine ve karbon ve metal buharlaşma transmisyon elektron mikroskobu (Şekil 1 ve Şekil tarafından incelenmesi için uygun bir kopyasını üretmek için olan 2).
Tipik örnek tablo ve alet kolu mikrotom düzenlenebilir sıvı azot throughput olan (Şekil 1) ile yüksek bir vakum odasına oluşur. Hazne aynı zamanda örnek aşamasına 90 ° bir açı ve PLATI için diğer uçta yer alan C-buharlaşma stabilize edilmesi için, iki elektron tabancası, bir ev45º (Şekil 2) – ayarlanabilir açı, tipik 15º de gölgeleme num / karbon. Ünitesine güç vakum pompayı çalıştırmak için uygulanır ve elektronik paneller sıcaklık ayarı ve elektron tabancası kontrolünü düzenlemek.
Başlangıçta muayene ve hücre zarlarının analizi ve uzmanlık 2, 3 için bir teknik olarak daha popülerlik kazanmıştır-kırığı, dondurma virüslerin gelişmiş görüntüleme elde etmek için bir araç olarak tasarlanmıştır. Nitekim, bu prosedür hücrelerin ve dokuların ve bu çalışmaların birçok hücre ve moleküler biyoloji 4-9 klasik katkıları olarak standı yapı / işlev ilişkileri nedenlerine açıklık ayrılmaz olmuştur. Donma-kırık tekniğinin gelişimi için ana amaç ve gerekçesi konvansiyonel biyolojik elektron mikroskobu kullanılan kimyasal sabitleme ve işleme kaynaklanan elektron mikroskobik çözünürlükte gözlemlenebilir eserler sınırlamak oldu. Burada amaç kimyasal sınırlamak içinsabitleme yeterli hızda ve genellikle buz kristal oluşumunu ve bir dondurucu eserler sınırlamak amacıyla, bir kriyokoruyucu mevcudiyetinde örnek dondurma ve. Daha yakın zamanlarda, bu teknik nanopartiküller ve nanomateryallerin incelenmesi için moleküler biyologlar ve malzeme bilimi araştırmacıları bir ilgi patlaması buldu.
-Kırığı dondurma ve dondurarak-etch görüntüleri üç boyutlu bir karakter sergileyen ve bazen tarama elektron mikroskopta için yanlış vardır. Bununla birlikte, donma-fraktür preparatlar transmisyon elektron mikroskobu ile incelenir ve yüksek çözünürlüklü morfolojik çalışmalarında, önemli bir katkı, hücre zarlarının yapı / fonksiyon elemanlarının kendi benzersiz bir temsilidir. Dondurarak kırık işlenmesi ve / veya gliserol gibi dondurarak saklama maddelerin kullanımı ile buz kristalleşmesini sınırlandırmak için yeterli bir hız ile hücreler ve dokuların dondurma ile başlatılır. Numuneler daha sonra vakum ve bir temsilcisi altında kırılmıştır edilirLica çatlak yüzeyi üzerinde platin, karbon ve buharlaştırılması ile elde edilir. Orijinal numune standart EM numune ızgara üzerine alınır kopyadan sindirilir. Donma-kırık görüntülerin başka bir yaygın yanlış yorumlanması onlar hücre yüzeylerine tasvir olmasıdır. Donma-kırık temel dayanak biyolojik membranlar kırılma süreci (Şekil 3) ile çift katlı lipid yoluyla bölünmüş olmasıdır Ancak. Biyolojik membranların Bu işlem, iki kırılma yüzü, hücre dışı bitişik membranın biyomoleküler broşürün yarısını ortaya sitoplazmadaki PF yüze bitişik membranın yarısının organizasyonunu göstermektedir bir ve bir verir ortam, EF-yüz. Gerçek hücre yüzeyleri donma kırık görüntüleri temsil ama kırık prosedür takip donma-gravür sonraki adımı eklendi kullanıldığında, yalnızca görünür değildir. Etkin yüzey detai ortaya çıkarmak için daha önce kırık örnekleri etch içinl numuneler bir hızla ve unetchablecryoprotectant olmadan donmuş olması gerekir. Yatan özellikleri ortaya kırık numunenin yüzeyinden suyun Gravür numune tutma aşaması arasında bir ısı farkı oluşturarak numune sahne üzerinde soğutma mikrotom kol ve yüzeyden süblime suyun neden soğutma mikrotom kolu konumlandırılmasıyla gerçekleştirilir. Su donma-etching manevrasında kırılan numune yüzeyinden süblime olduğu zaman, gerçek hücre yüzeylerinde, hücre dışı matrisin, sito-skeletal yapıları ve moleküler düzeneklerinin gereksinimleri yüksek çözünürlükte açığa çıkarılabilir. Böylece-donma kırık ve-etch dondurma değiştirilebilir terimler değil, aksine son hangi belirli çalışmanın ihtiyaçlarına bağlı olarak gerekli veya arzu olmayabilir adım adım sürecini yansıtmaktadır.
Donma-kırığı sonrası / donma-etch prosedürleri, kırılan yüzeyler yönettiği evapora tabi tutulurlaryineleme destek ve görüntüleme kontrast sağlamak amacıyla karbon ve platin kat tive. Platin / karbon görüntüleme buharlaştırma tek yönlü ya da döner olabilir ve direnç veya elektron tabancası ya da gerçekleştirilir. Bilinen bir açı, tipik 30º tek yönlü gölgeleme – 45º, bazı morfometrik performans hesaplamaları yararlıdır. Derin dağlama maruz kalmış örnekler, normalde gölgeli döner ve bu örneklerin sonuçta görüntüleri fotografik değerlendirme için tersine çevrilir.
Tarihi hem de donma-fraktür / donma etch tekniğin mevcut bir amacı daha geleneksel bir transmisyon elektron mikroskobu prosedürler ile ilişkilidir eşya örneği, kimyasal tespiti ve işleme sınırlamaktır. Ancak, bu teknik ve n, üç boyutlu detay görüşmek ve dolayısıyla biyolojik, malzeme bilimi morfometrik verilere edinimini kolaylaştırmak için yeteneği bir maddi avantaj sağlaranotechnology örnekler. Kırık-Freeze ve donma-etch işlemleri karmaşık ve çok boyutludur ve uygulamanın bazı yönleri özelleştirilmiş. Bu sunum sürecinin önemli özelliklerinden bir anket görünüm sunuyor ve okuyucu özel araştırma ihtiyaçları için süreci ayrıntıları ele almak ve özelleştirmek amacıyla kapsamlı yayınlanan protokolleri 10, 11 anılır.
Onun tanıtımı ve ticari kullanılabilirliği takip yıllarda, donma-kırık / aşındırma prosedürleri yaygın biyolojik membran yapısının araştırmalar için kullanılmıştır. Aslında, membran yapısal özellikleri, bazı en iyi ve en bakış donma-fraktür / aşındırma preparasyonlarda elde edilmiştir. Bu çalışmalar sadece membranların yapısal organizasyonu anlaşılmasına katkıda ama aynı zamanda yapısı ve fonksiyonu ile ilgili nasıl içgörüler sağladı.
Rutin…
The authors have nothing to disclose.
This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency’s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
Standard buffers | various suppliers | ||
standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
sodium dichromate | various suppliers | ||
sulfuric acid | various suppliers | ||
Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
Liquid nitrogen | various suppliers | ||
Freon | various suppliers | ||
Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |