Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir biochemische Assays, die zur Charakterisierung von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzymen verwendet werden können, um 1) ATP-abhängiges Nukleosomengleiten zu katalysieren, 2) mit Nukleosomensubstraten zu interagieren und 3) ATP auf nukleosomen- oder DNA-abhängige Weise zu hydrolysieren.

Zusammenfassung

Mitglieder der SNF2-Familie von ATPasen fungieren oft als Komponenten von Multi-Subunit-Chromatin-Remodeling-Komplexen, die die Nukleosomendynamik und DNA-Zugänglichkeit regulieren, indem sie den ATP-abhängigen Nukleosomenumbau katalysieren. Die biochemische Zerlegung der Beiträge einzelner Untereinheiten solcher Komplexe zur mehrstufigen ATP-abhängigen Chromatin-Umbaureaktion erfordert die Verwendung von Assays, die die Produktion von Reaktionsprodukten überwachen und die Bildung von Reaktionszwischenprodukten messen. Dieses JOVE-Protokoll beschreibt Assays, die es ermöglichen, die biochemischen Aktivitäten von Chromatin-Remodeling-Komplexen oder -Unterkomplexen zu messen, die verschiedene Kombinationen von Untereinheiten enthalten. Der Chromatin-Remodeling wird mit einem ATP-abhängigen Nukleosomen-Gleitassay gemessen, der die Bewegung eines Nukleosoms auf einem DNA-Molekül mit einer auf elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassays (EMSA) basierenden Methode überwacht. Die Nukleosomenbindungsaktivität wird gemessen, indem die Bildung von komplexgebundenen Mononukleosomen im Umbau mit einer ähnlichen EMSA-basierten Methode überwacht wird, und die DNA- oder Nukleosomen-abhängige ATPase-Aktivität wird mittels Dünnschichtchromatographie (DC) gemessen, um die Umwandlungsrate von ATP in ADP und Phosphat in Gegenwart von DNA oder Nukleosomen zu messen. Mit diesen Assays kann man die Funktionen von Untereinheiten eines Chromatin-Remodeling-Komplexes untersuchen, indem man die Aktivitäten des gesamten Komplexes mit denen vergleicht, denen eine oder mehrere Untereinheiten fehlen. Als Beispiel wird der humane INO80-Chromatin-Remodeling-Komplex verwendet; Die hier beschriebenen Methoden können jedoch auf die Untersuchung anderer Chromatin-Remodeling-Komplexe angepasst werden.

Einleitung

SNF2 Familie Chromatin-Remodeling Komplexe umfassen eine zentrale SNF2-ATPase-Untereinheit wie ^1,2. Einige SNF2 artigen ATPasen Funktion als einzelne Untereinheit Enzyme, andere Funktion als die katalytische Untereinheit von größeren Multi-Untereinheiten-Komplexen. Aufklärung der molekularen Mechanismen, durch die jede der Untereinheiten von Chromatin-Remodeling-Komplexe beitragen, ihre Tätigkeit erfordert die Fähigkeit, biochemische Assays, die die Umbauprozess auszuführen sezieren.

ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling vom menschlichen INO80 Komplex und andere Chromatin-Remodeling-Enzyme können nach einem mehrstufigen Prozess, d....

Protokoll

1. ATP-abhängigen Nucleosome Remodeling Assays

Zur Messung ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling-Aktivitäten, immun INO80 oder INO80 Subkomplexe mit ATP und einem mononucleosomal Substrat, welches eine einzelne Nukleosomen an einem Ende eines 216-bp-, ³² P-markierten DNA-Fragment enthält, angeordnet inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden dann einer Elektrophorese in nativen Polyacrylamid-Gelen unterzogen.

1. Die ³² P-markierten, "601"-DNA-Fragment zu erzeugen, zu verstärken, aus pGEM-3Z-601 ⁴ a 216 bp DNA-Fragment, enthaltend eine endständige 601 Nukleosomen Positionierungssequenz unter Verwendung de....

Ergebnisse

Die Zahlen zeigen repräsentative Ergebnisse von biochemischen Tests zur INO80 Aktivitäten charakterisieren, einschließlich Nukleosomen Schiebe (Abbildung 1) und Bindung (Abbildung 2)-Assays und DNA-oder Nukleosomen-abhängige ATPase-Assays (Abbildung 3).

Die in Figur 1 gezeigte Experiment vergleicht die Fähigkeit von intakten Komplexen durch INO80 FLAG-Ies2 oder FLAG-INO80E gereinigt und INO80 Subkomplexe durch entweder FLAG-.......

Diskussion

Um sicherzustellen, dass Nukleosomen Umbau-und ATPase-Aktivitäten, die wir in Tests zu beobachten, hängt von der katalytischen Aktivität des INO80 Komplexe und nicht auf kontaminierende Umbau-und / oder ATPase-Enzyme, die wir routinemßig Assay Nukleosom Umbau-und ATPase-Aktivität der katalytisch inaktiven Versionen INO80 Komplexe, gereinigt parallel mit Wildtyp-INO80 mit dem gleichen Verfahren. Eine negative Kontrollreaktion fehlt ATP sollte auch bei der Untersuchung von Nukleosomen Umbau Aktivität, um das Vorhandensein.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Protease-Inhibitor-Cocktail	Sigma	P8340
10x PCR-Reaktionspuffer	Roche Angewandte Wissenschaften
Roche Taq DNA-Polymerase	Roche Angewandte Wissenschaft
NucAway Nuklease-freie Spin-Säulen	Ambion	Kat. # AM10070
hochreines ATP	USB/Affymetrix	77241 25 μm
Rinderserumalbumin	Sigma	A9418
40% Acrylamid/Bis 37,5:1	Amresco	0254-500ML
Beschallte Lachsspermien-DNAs	GE Healthcare	27-4565-01
10 % Ammoniumpersulfat (APS)	Thermo Scientific	17874
Benzonase	Novagen	Kat. Nr. 70664
dCTP, [α-32P]- 6.000 Ci/mmol	PerkinElmer	BLU013Z250UC
PCR-Thermocycler PTC 200	MJ Research	PTC 200
Hoefer vertikale Elektrophoreseeinheit	Hoefer	SE600X-15-1,5
geschmierte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen	Costar	3207
Speicher-Phosphor-Sieb	Molecular Dynamics	63-0034-79
3MM Filterpapier	Whatman	28458-005	VWR
Typhoon PhosphorImager	GE Healthcare	8600
ImageQuant Software	GE Healthcare	ver2003.02
DC-Glasplatten, PEI-Cellulose F	Millipore	5725-7
Immobilon-FL Transfermembran 7 x 8,4	Millipore	IPFL07810
Allzweck-Vermessungsmessgerät mit Endfenster oder Pfannkuchensonde GM (Geiger-Müller)	Biodex	Modell 14C

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