Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Khujista D. Haque; Atul K. Pandey; Matthew W. Kelley; Chandrakala Puligilla

doi:10.3791/52260

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Methodenartikel

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

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DOI:

10.3791/52260

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12. Januar 2015

Khujista D. Haque¹ , Atul K. Pandey¹ , Matthew W. Kelley² , Chandrakala Puligilla¹

¹Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, College of Medicine, ²Laboratory of Cochlear Development, NIDCD, NIH

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode vor, die die Isolierung und Kultur von Cochlea-Explantaten aus embryonalen Maus-Innenohren beschreibt. Wir demonstrieren auch eine Methode für den Gentransfer in Cochlea-Explantate mittels Rechteck-Elektroporation. Die In-vitro-Explantatkultur in Verbindung mit der Gentransfertechnik ermöglicht es den Forschern, die Auswirkungen einer Veränderung der Genexpression während der Entwicklung zu untersuchen.

Zusammenfassung

Auditorische Haarzellen, die sich im Mausorgan von Corti befinden, erkennen und leiten Schallinformationen an das zentrale Nervensystem weiter. Die mechanosensorischen Haarzellen sind in einer Reihe von inneren Haarzellen und drei Reihen von äußeren Haarzellen ausgerichtet, die sich entlang der basalen bis apikalen Achse der Cochlea erstrecken. Die hier beschriebene Explantatkulturtechnik bietet eine effiziente Methode zur Isolierung und Erhaltung von Cochlea-Explantaten aus dem embryonalen Innenohr der Maus. Auch die Morphologie und die molekularen Eigenschaften von sensorischen Haarzellen und nicht-sensorischen Stützzellen in den Cochlea-Explantatkulturen ähneln denen, die in vivo beobachtet wurden, und können in ihrer intrinsischen zellulären Umgebung untersucht werden. Die Cochlea-Explantate können als wichtige experimentelle Werkzeuge für die Identifizierung und Charakterisierung molekularer und genetischer Signalwege dienen, die an der zellulären Spezifizierung und Musterbildung beteiligt sind. Obwohl transgene Mausmodelle einen effektiven Ansatz für Genexpressionsstudien bieten, stirbt eine beträchtliche Anzahl von Mausmutanten während der Embryonalentwicklung ab, was die Analyse und Interpretation von Entwicklungsphänotypen behindert. Das Corti-Organ von mutierten Mäusen, die vor der Geburt sterben, kann kultiviert werden, so dass ihre in vitro Entwicklung und Reaktionen auf verschiedene Faktoren analysiert werden können. Darüber hinaus beschreiben wir eine Technik zur Elektroporation embryonaler Cochlea-Explantate ex vivo, die zur Herunter- oder Überexpression bestimmter Gene verwendet werden kann, um ihre potentielle endogene Funktion zu analysieren und zu testen, ob ein spezifisches Genprodukt in einem gegebenen Kontext notwendig oder ausreichend ist, um die Cochlea-Entwicklung von Säugetieren zu beeinflussen^1-8.

Einleitung

Das Säugetierorgan Corti besteht aus einem Mosaik spezialisierter Zelltypen, darunter zwei Arten von mechanosensorischen Haarzellen sowie mindestens vier Arten von nicht-sensorischen Unterstützungszellen, was es zu einem idealen Modellsystem macht, um normale zelluläre Prozesse wie Proliferation, Schicksalsspezifikation, Differenzierung und Musterbildung zu untersuchen. Darüber hinaus ist die normale Entwicklung dieser verschiedenen Zelltypen essentiell für eine normale Hörfunktion. Daher ist es wichtig, die molekularen und zellulären Faktoren zu verstehen, die ihre Entwicklung regulieren. Die geringe Größe der Maus-Cochlea sowie ihre Unzugänglichkeit stellen jedoch e....