Es wurde eine Methode entwickelt, um direkt abzuleiten humanen neuralen Stammzellen aus hämatopoetischen Vorläuferzellen aus peripherem Blut Zellen angereichert.
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Methodenartikel
Direkte Induktion von humanen neuralen Stammzellen aus peripherem Blut hämatopoetischen Vorläuferzellen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Menschliche Krankheit spezifischen neuronalen Kulturen sind für die Erzeugung von in-vitro-Modellen für neurologische Erkrankungen des Menschen. Der fehlende Zugang zu primären humanen adulten neuralen Kulturen wirft jedoch einzigartige Herausforderungen. Die jüngsten Entwicklungen in induzierte pluripotente Stammzellen (iPS) bietet einen alternativen Ansatz zur neuronalen Kulturen aus Hautfibroblasten durch patientenspezifische iPS ableiten, aber dieser Prozess ist arbeitsintensiv, erfordert spezielles Know-how und große Mengen an Ressourcen und kann mehrere Monate dauern. Dies verhindert, dass die breite Anwendung dieser Technologie auf die Untersuchung von neurologischen Erkrankungen. Um einige dieser Probleme zu überwinden, haben wir eine Methode, um neurale Stammzellen direkt aus menschlichen adulten peripheren Blut abgeleitet entwickelt, unter Umgehung der iPSC Ableitungsprozesses. Hämatopoetischen Vorläuferzellen aus humanen adulten peripheren Blut angereichert wurden in vitro kultiviert und mit Sendai-Virus-Vektoren, die Transkriptionsfaktoren Sox2, Oktober transfiziert3/4, Klf4 und c-Myc. Die Transfektionsergebnisse in morphologischen Veränderungen in den Zellen, die unter Verwendung von humanen neuralen Vorläufer Medium mit basischem Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) weiterhin ausgewählt sind. Die resultierenden Zellen werden durch die Expression neuronaler Stammzellenmarker wie Nestin und SOX2 gekennzeichnet. Diese Nervenstammzellen könnte weiter zu Neuronen, Astroglia und Oligodendrozyten in bestimmten Differenzierungsmedien unterschieden werden. Mit leicht zugänglichen menschlichen peripheren Blut-Proben, könnte diese Methode verwendet werden, um neurale Stammzellen zur weiteren Differenzierung zu Nervenzellen für In-vitro-Modellierung von neurologischen Störungen abgeleitet werden und können Studien zur Pathogenese und Behandlung dieser Krankheiten zu fördern.
Einleitung
In vitro haben neuronalen Kulturen als ein grundlegendes Instrument für die Untersuchung von neurologischen Erkrankungen eingesetzt. Primäre tierische (meist Nagetier) neuronalen Kulturen 1, 2 und humanen neuralen Zelllinien aus Gliomen und anderen Tumore abgeleitet sind die am häufigsten verwendete in solchen Studien. Jedoch wurde erkannt, dass es signifikante Unterschiede zwischen Nager- und menschliche Zellen. Viele Erkenntnisse basierend auf Nagetiere können nicht auf den Menschen übertragen werden. Darüber hinaus mit der rasanten Entwicklung bei der Analyse von Massen genomischer Informationen und die relativ einfach Gen Bearbeitung und Seque....
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Protokoll
1. Anreicherung von hämatopoetischen Vorläuferzellen aus Vollblut Erwachsene
HINWEIS: Hämatopoetische Vorläuferzellen oder CD34 + Zellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus einer Vielzahl von Quellen einschließlich Nabelschnurblut, Leukapherese Material und Vollblut mittels Dichtegradientenzentrifugation basieren Verfahren abgeleitet, gereinigt werden. Die hier aufgeführte Methode verwendet Vollblut als Beispiel.
- Isolierung von PBMCs aus Vollblut:
- Hinzufügen 4,5 ml der Lymphozytentrennmedium zum SepMate Rohr pipettiert es durch die zentrale Bohrung des Einsatzes ist.
- Verdünne die Blutprobe mit....
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Ergebnisse
Die Qualität der CD34-Zellen ist kritisch für den Erfolg der neuronalen Stammzellübertragung. Hochwertige CD34-Zellen vermehren sich während der ersten paar Tage der Kultur und erscheinen als nicht haftende, homogene Rundzellen, Schwimm knapp über dem Boden der Kulturgefäße (Abbildung 1A). Die erfolgreiche Infektion führt zu Zellaggregaten, die im Laufe der Zeit (Abbildung 1B) erweitert, während unspezifische Zellaggregate können während der Zellkultur auf, die sich ausdehnen und .......
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Diskussion
Ein detailliertes Protokoll, um direkt zu generieren neuralen Stammzellen aus dem peripheren hämatopoetischen Vorläuferzellen ist.
Im Vergleich zu Fibroblasten, ist menschlichem peripheren Blut leichter zugänglich. Verwendung des vorgestellten Protokoll, mehr als 1 x 10 5 hämatopoetischen Vorläuferzellen oder CD34-positiven Zellen aus 10 ml Vollblut angereichert werden. Obwohl Kontamination mit Blutplättchen ist normalerweise nicht vermeidbar, kann es leicht durch Niederalkyl Zent.......
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Offenlegungen
Die Studie wird von NIH-internen Fonds finanziert.
Danksagungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Lymphozyten-Trennmedium | Lonza | 17-829E | 1x |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 ml |
| Humanserum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotika | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2 mM |
| MACS LS Säule | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM Medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1x |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1x |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/ml |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/ml |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/ml |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/ml |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/ml |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life Technologies | A1378001 | |
| Zellschaber | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube Fläschchen | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty Behälter | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12400-024 | 1x |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x |
| Rinderserumalbumin | Sigma | A2934 | 0,1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Nahrungsergänzungsmittel | Life Technologies | 17504-044 | 1x |
| NSC Serum freies Medium | Life Technologies | A1050901 | 1x |
| Poly-D-Lysin/Laminin beschichtete Deckgläser | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0,2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-Ornithin | Sigma | P4957 | 1x |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Qualität biologisch | 119-069-101 | 1x |
| Ziegenserum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Maus monoklonales Anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1.000 Verdünnung |
| Anti-SOX2 Antikörper | Angelegte Stammzell-ASA0120 | Gebrauchsfertiges | |
| Maus-Anti-Β III-Tubulin-Antikörper | Promega | G712A | 1:1.000 Verdünnung |
| Kaninchen Anti-GFAP-Antikörper | Sigma | G4546 | 1:100 Verdünnung |
| Anti-O4-Antikörper | R& D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 Anti-Kaninchen-Antikörper | Lebenstechnologien | A11012 | :400 Verdünnung |
| Alexa Fluor 488 Anti-Maus-Antikörper | Lebenstechnologien | A11001 | :400 Verdünnung |
| Alexa Fluor 488 Anti-Maus-IgM-Antikörper | Lebenstechnologien | A21042 | :250 Verdünnung |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 μ g/ml |
Referenzen
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941(2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neurob....
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Nachdrucke und Genehmigungen
