بلعم الكولسترول استنفاد وتأثيره على البلعمة من<em> المستخفية المورمة</em
Summary
In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.
Abstract
المستخفيات هو عدوى تهدد الحياة التي تسببها الفطريات المسببة للأمراض من جنس المستخفية. تحدث العدوى عند استنشاق جراثيم، والتي هي قادرة على تكرار في الرئة العميقة. البلعمة من المستخفية بواسطة الضامة هي واحدة من الطرق أن هذا المرض هو قادرة على الانتشار في النظام العصبي المركزي لتسبب التهاب السحايا والدماغ القاتل. لذلك، ودراسة العلاقة بين المستخفية والضامة مهمة لفهم تطور العدوى. تصف هذه الدراسة بروتوكول خطوة بخطوة لدراسة البلاعم العدوى التي كتبها C. الأدعومية في المختبر. باستخدام هذا البروتوكول، ودرس دور الجامدة المضيف على التفاعلات المضيف الممرض. استخدمت سيكلودكسترين (MCD) في استنزاف الكولسترول من الفئران شبكية ساركوما مثل بلعم خط الخلية J774A.1 – تركيزات مختلفة من الميثيل. وأكد استنزاف الكولسترول وكميا باستخدام كل من المتوفره تجاريامواقع الحكومة الإلكترونية عدة الكولسترول الكمي وطبقة رقيقة اللوني. تم تنشيط خلايا الكوليسترول المنضب باستخدام Lipopolysacharide (LPS) والانترفيرون غاما (IFNγ) وإصابة مع opsonized الأجسام المضادة المستخفية المورمة البرية من نوع الخلايا H99 في نسبة المستجيب إلى الهدف 1: 1. تم رصد الخلايا المصابة بعد 2 ساعة من الحضانة مع C. تم حساب الأدعومية ومؤشر على البلعمة. أدى استنزاف الكولسترول في انخفاض كبير في مؤشر البلعمة. البروتوكولات قدمت وتقدم طريقة مريحة لمحاكاة بدء عملية العدوى في بيئة المختبر ودراسة دور تكوين الدهون المضيف على العدوى.
Introduction
البلعمة هي العملية التي يتم المنضوية كيانات خارج الخلية من قبل الخلايا المضيفة. بل هو سلاح أساسي في ترسانة النظام المناعي للدفاع ضد مسببات الأمراض، ولكن قد تكون في كثير من الأحيان تخريب العملية التي مسببات الأمراض للسماح لاستيعاب ونشر في جميع أنحاء الجسم 1. وبوساطة البلعمة من قبل العديد من الأحداث يشير إلى أن يؤدي إلى التعلق والغمر عن طريق إعادة ترتيب الهيكل الخلوي الخلية المضيفة. البالعات "الفنية" قادرة على إدراك وربط opsonins على سطح الممرض الغازية للإشارة لمرفق وتشكيل أقدام صفاحية التي تبتلع الممرض وتشكيل يبلوع 2. ومن بين ما يسمى البالعات 'المهنية' هم الضامة. الضامة هي خلايا متخصصة للغاية التي تنفذ مهام الحماية التي تشمل السعي إلى القضاء على المرض والعوامل المسببة، وإصلاح الأنسجة التالفة، والتوسط من الالتهاب، ومعظمهذه من خلال عملية البلعمة 1،2.
المستخفية المورمة هي الأنواع من الخميرة الممرضة التي تسبب مرض خطير يعرف باسم المستخفيات. يتم استنشاق الجراثيم المستخفية من قبل المضيف ويؤدي الى عدوى رئوية التي عادة ما تكون أعراض. ويعتقد أن التعرض منتشر للغاية. وقد أظهرت عينة من 61 طفلا من الأمراض المعدية للأطفال عيادة في مركز مستشفى برونكس لبنان وجدت أن كل الذين شملهم الاستطلاع كان الأجسام المضادة للglucuronoxylomannan السكاريد بالمستخفيات وغيرها من الدراسات انتشار في كل من فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) غير مصاب والبالغين المصابين 3، 4. الضامة السنخية هي الخط الأول للاستجابة للعدوى رئوية واضح في معظم الحالات بنجاح الممرض. ومع ذلك، في الأفراد المناعة (المرضى على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية والإيدز) الخميرة قادرة على البقاء على قيد الحياة داخل الضامة. في هذهالحالات، يمكن للالضامة بمثابة محراب للتكرار من مسببات المرض ويمكن أن تسهل نشرها على الجهاز العصبي المركزي (CNS) حيث يصبح المرض قاتلا 5-8. ويعتقد أن الضامة حتى يمكن تقديم الخميرة مباشرة في السحايا، مما يساعد الخميرة لعبور حاجز الدم في الدماغ عن طريق "حصان طروادة" نموذج 3،9 – 11. وبالتالي، فمن المهم أن نفهم عملية البلعمة والعوامل التي تؤثر عليه، وخاصة في الالتهابات بالمستخفيات.
العمل السابق في أنظمة الممرض أخرى تشير إلى الكولسترول والدهون الطوافات التي شكلتها الكولسترول وجود دور هام في البلعمة 12-15. الكولسترول هو النوع الأكثر وفرة الدهون في خلايا الثدييات، وتضم 25 – 50٪ من غشاء الخلية الثدييات 16. وقد وجد أن تلعب دورا في تحوير BIOPخصائص hysical الأغشية عن طريق تغيير صلابة من 17. الكولسترول والإسفنجية تشكل معا microdomains الدهون داخل غشاء المعروفة باسم الطوافات الدهنية. تم العثور على الطوافات الدهنية أن تشارك في تشكيل caveolae، فضلا عن توفير مجال معزولة لأنواع معينة من إشارات 16-18. نظرا لصغر حجمها، فمن الصعب لدراسة الطوافات الدهنية في الجسم الحي. طريقة واحدة مفيدة لدراسة دور الطوافات الدهنية هو تغيير ناخبيهم. الميثيل-β-سيكلودكسترين (MβCD) هو مركب التي تم العثور عليها في استنزاف الكولسترول من الأغشية الثدييات ويستخدم عادة لدراسة دور الطوافات الدهنية 18.
في هذا البروتوكول، ونحن نقدم وسيلة لاستنزاف الكولسترول من أغشية الخلية المضيفة وقياس تأثير استنزاف على قدرة الخلايا المضيفة في phagocytose C. الأدعومية في المختبر. هذا الإجراء يجعل من استخدام زراعة الخلايا TECHNIQUES على البلاعم خلد مثل خط الخلية (J774A.1) كنموذج للعدوى. تم انجازه استنزاف الكولسترول عن التعرض لMβCD، والذي له نواة مسعور محدد لحجم الجامدة وغير قادرة على بمثابة بالوعة للالكولسترول لاستدراجه للخروج من غشاء 19. وقد تم قياس نضوب الكولسترول كميا باستخدام عدة المتاحة تجاريا ونوعيا باستخدام بلي-داير استخراج الدهن تعديل تليها طبقة رقيقة اللوني (TLC) 20. . تم قياس البلعمة عن طريق إصابة خط الخلية مع ثقافة الخميرة opsonized مختلطة مع كوكتيل من انترفيرون γ وlipopolysaccharide في تفعيل الضامة وopsonized المستخفية باستخدام glucuronoxylomannan (GXM) الأجسام المضادة 21-23. تلطيخ والتجارب المجهري سمحت لرؤية الخلايا وحساب مؤشر أكلة لتقييم درجة البلعمة. أخذت معا، وهذا البروتوكول دescribes طريقة الأساسي الذي يدمج تغيير تركيبة الدهون مع عملية الفسيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في العمل مع هذا البروتوكول من المهم الحصول على عدد خلايا دقيقة عندما تصفيح خلايا الثدييات وopsonizing C. خلايا الأدعومية. هذا يقلل من التباين بين التجارب ويضمن ودقيقة 1: 1 هدف إلى نسبة المستجيب طوال فترة الدراسة. فمن الأهمية بمكان لتنسيق توقيت استنزاف الكولسترول و…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح NIH AI56168، AI71142، AI87541 وAI100631 إلى MDP. ماوريتسيو ديل POETA هو بوروز ويلكوم باحث في مجال الأمراض المعدية.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-Cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations |
| Orbital Shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC Chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume Hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well Plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell Scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex Mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S Meaures down to .1 mg | |
| Glass Pasteur Pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum Ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine Chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese Chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass Bottom Confocal Dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
Referenzen
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
- Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
- Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
- Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
- Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
- Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
- Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
- Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
- García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
- Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, 415-423 (2003).
- Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
- Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
- Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
- Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
- Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
- Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
- Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
- Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).
