Makrophagen-Cholesterin Depletion und Auswirkungen auf die Phagozytose<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Protokoll für die Infektion von Makrophagen mit Cryptococcus neoformans beschrieben. Außerdem wird eine Methode zur Sterolabbaution aus den Makrophagen erläutert. Diese Protokolle bieten einen Leitfaden für die Untersuchung von Pilzinfektionen in vitro und die Untersuchung der Rolle von Sterolen bei solchen Infektionen.

Zusammenfassung

Cryptococcosis ist eine lebensbedrohende Infektion, die von pathogenen Pilzen der Gattung Cryptococcus verursacht. Die Infektion erfolgt beim Einatmen von Sporen, die in der Lage, in die tiefe Lunge replizieren. Phagozytose von Cryptococcus durch Makrophagen ist eine der Möglichkeiten, dass die Krankheit in der Lage, in das zentrale Nervensystem verteilt, um letale Meningoenzephalitis führen. Daher ist die Lehre der Assoziation zwischen Cryptococcus und Makrophagen wichtig für das Verständnis des Fortschreitens der Infektion. Die vorliegende Studie beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Protokoll, um Makrophagen-Infektiosität von C. studieren neoformans in vitro. Mit diesem Protokoll wird die Rolle des Gastgebers Sterole auf Wirt-Pathogen-Interaktionen untersucht. Verschiedene Konzentrationen von Methyl - Cyclodextrin (MCD) wurden verwendet, um Cholesterin aus murinen Retikulum Sarkom Makrophagen-ähnlichen Zellinie J774A.1 abzureichern. Cholesterinabbau bestätigt und quantifiziert unter Verwendung sowohl einer handels verfügbe Cholesterinquantifizierung Kit und Dünnschicht-Chromatographie. Cholesterin verarmte Zellen wurden unter Verwendung Lipopolysacharide (LPS) und Interferon gamma (IFN & gamma;) aktiviert und mit Antikörper-opsonisiertes Cryptococcus neoformans Wildtyp H99 Zellen bei einem Effektor-zu-Ziel-Verhältnis von 1 infiziert: 1. Infizierte Zellen wurden nach 2 h Inkubation mit C. wachten neoformans und ihre phagozytische Index wurde berechnet. Cholesterinabbau führte zu einer signifikanten Reduktion der phagozytische Index. Die vorgestellten Protokolle bieten eine bequeme Methode, um die Einleitung des Infektionsprozesses in einer Laborumgebung nachzuahmen und Studium der Rolle von Wirtslipidzusammensetzung auf die Infektiosität.

Einleitung

Phagozytose ist ein Prozess, durch den extrazellulären Instanzen durch Wirtszellen internalisiert. Es ist eine wichtige Waffe im Arsenal des Immunsystems, gegen Krankheitserreger zu verteidigen, aber der Prozess kann oft von Krankheitserregern unterlaufen werden, um für die Internalisierung und Verbreitung im ganzen Körper ¹ zu ermöglichen. Die Phagozytose wird durch mehrere Signalwege, die im Anhang und Einwirkung über Umlagerungen von Zytoskelett der Wirtszelle führen vermittelt. Professional "Phagocyten können sich auf der Oberfläche des eindringenden Pathogens erkennen und binden an Opsonine zur Anbringung und die Bildung der Lamellipodia, die den Kran....

Protokoll

1. Cholesterin Depletion von J774A.1 Zellen mit MßCD

1. In einem sterilen biologischen Sicherheitswerk, Samen 10 ⁵ J774A.1-Makrophagen-ähnlichen Zellen pro Well auf einer 96-well-Zellkulturplatte in 200 ul Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin (P / S). Bei 37 ° C und 5% CO & _{sub2; O} / N.
2. Medium entfernt von der Zellmonoschicht und die Zellen werden zweimal mit 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), die gefiltert und autoklavierbar ist.
3. Fügen Sie 200 ul MßCD Lösung in der gewünschten Konzentration (10 mM oder 30 mM in PBS) oder 1x PBS als Kon....

Ergebnisse

Cholesterin Depletion

Analyse des Überstands in Stufe 1.3 des Protokolls durch folgende Anweisungen des Herstellers im Amplex Red Cholesterol Assay Kit vorbehalten ergibt eine erhöhte Konzentration von Cholesterin in MßCD behandelten Probe im Vergleich zu der 1x PBS-Kontrolle. Je nach Zelltyp und MßCD Konzentration verwendet Cholesterinabbau kann variieren. Für J774 mit 10 mM MßCD behandelt wurde eine Abreicherung von ca. 50% beobachtet. Depletion kann mit aus dem Überstand und Zelllysat in Sch.......

Diskussion

Bei der Arbeit mit diesem Protokoll ist es wichtig, genaue Zellzählungen beim Plattieren Säugetierzellen und opsonisierenden C erhalten neoformans Zellen. Dies minimiert die Unterschiede zwischen Studien und gewährleistet eine exakte 1: 1-Ziel-Effektor-Verhältnis während der gesamten Studie. Es ist auch wichtig, um das Timing des Cholesterinabbau und Infektion zu koordinieren, um die opsonisierten Hefezellen oder behandelten Makrophagen aus ruhenden bei RT zwischen den Verfahren zu verhindern. Lange Wa.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Biosicherheitswerkbank der Klasse II Typ A2	Labconco	3460009
J774A.1 Zelllinie	ATCC	TIB-67	Kommt gefroren an. Siehe ATCC-Anleitung für die Kultivierung.
Dulbecco' s Modified Eagle Medium	Gibco	11995-065	Bei 4 > C und warm auf 37 &°; C vor der Anwendung
HI Fetal Rinderserum Performance Plus	Gibco	10082-147	Bei -20 & Grad eingefroren halten; C und Tauen vor der Zugabe zu DMEM
auf Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	Gibco	15140-122	Zur Ergänzung von DMEM
Isotemp Zellkultur-Inkubator	Fisher Scientific		Modell # 3530
96-Well-Kulturschale	Corning Inc. Costar	3595
10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung	Fisher Scientific BioReagents	BP3994	Auf 1x verdünnen und vor Gebrauch filtrieren oder autoklavieren.
Methyl-β-Cyclodextrin	Sigma Life Science	C4555-10G	In 1x PBS auflösen, um Lösungen mit Konzentrationen von 10 mM und 30 mM
herzustellen Orbitalschüttler	Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit	Life Technologies Molekulare Sonden	A12216	Alle Reagenzien für den Cholesterin-Assay sind im Kit enthalten. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers.
96-Well-Schwarz-Assay-Platte	Corning Inc. Costar	3603
FilterMax Mikroplatten-Reader	Molecular Devices		Modell F5
DC-Kammer	Sigma-Aldrich	Z126195-1EA
Chloroform	Sigma-Aldrich	650498-4L
Methanol	Sigma-Aldrich	34860-2L-R
TLC Papier	Whatman	3030917	Auf die für den DC-Tank erforderliche Größe zuschneiden
Abzug			Jeder Abzug, der den AIHA/ANSI-Standards entspricht
6-Well-Platte	Corning Inc. Costar	3506
Trypsin-EDTA	Gibco	25300-054
Zellschaber	Corning Inc. Costar	3010
Hämozytometer	Hausser Scientific	1490
Zentrifuge	Beckman Schar		Modell Alegra x-30R
Votex Mischer	Fisher Scientific	12-812
Balance	Mettler Toledo		Modell # MS104S misst bis zu 0,1 mg
Glas Pasteur Pipette	Fisherbrand	13-678-20A
Cholesterin	Avanti Polar Lipide	700000
SpeedVac Konzentrator	Thermo Scientific		Modell # SPD2010
	Petrolether Fisher Scientific	E139-1
Diethylether	Sigma-Aldrich	309966
Essigsäure	Sigma-Aldrich	320099
TLC Silica Gel 60 mit Konzentrationszone	Analytische Chromatograhy Millipore	1.11845.0001
Jodchips	Sigma-Aldrich	376558-50G
Schwefelsäure	Sigma-Aldrich	320501
Manganchlorid	Sigma-Aldrich	244589
UVP EC3 Imaging	System Ultra-Violet Products Ltd.		Verwenden Sie die Vision Works LS-Software für die Densitometrie-Analyse
Konfokalschale mit Glasboden	MatTek	P35G-1.5-10C	www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99)			Bezogen vom Duke University Medical Center
YNB	BD	239210	Zubereitungshinweise finden Sie unter Hersteller. Verwenden Sie eine Glukosekonzentration von 20 g/L.
Lipopolysaccharid	Sigma	L4391-1MG	1x PBS auflösen, um 1 mg/ml Brühe herzustellen. Bei -20 °C lagern.
Interferon gamma	Sigma	I4777	In 1x PBS auflösen, um 0,1 mg/ml Stammlösung
herzustellen Glucuronoxylomannan-Antikörper (Anti-GXM)			Geschenk aus Arturo Casadevalls Laborkonzentration beträgt 1,98 mg/ml
Giemsa	MP Biomedicals	194591	0,8 g Giemsa in 25 ml Glycerin auflösen und auf 60 μg erhitzen; C für 1 Std. 25 ml Methanol in die Lösung geben und mindestens 1 Monat bei Raumtemperatur reifen lassen.
Mikroskop	Zeiss		Observer.D1 Mikroskop mit AxioCam MRm zum Aufnehmen von Bildern

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