Reife Adipozyten können durch Dedifferenzierung eine reichhaltige Quelle für Stammzellen darstellen, was zu einer homogenen Population von Fibroblasten-ähnlichen Zellen führt. Der Kollagenaseverdau wird verwendet, um reife Adipozyten aus menschlichem Fett zu isolieren. Das Ziel unseres Protokolls ist es, multipotente, dedifferenzierte Fettzellen aus humanen reifen Adipozyten zu gewinnen.
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Methodenartikel
Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Reife Adipozyten haben gezeigt, dass sie ihren Phänotyp in vitro durch eine Technik namens Deckenkultur in Fibroblasten-ähnliche Zellen umkehren. Reife Adipozyten können auch aus frischem Fettgewebe isoliert werden, um ihre Funktion und metabolischen Eigenschaften depotspezifisch zu charakterisieren. Hier beschreiben wir ein gut etabliertes Protokoll zur Isolierung reifer Adipozyten aus Fettgewebe mittels Kollagenase-Verdau und nachfolgende Schritte zur Durchführung von Deckenkulturen. Kurz gesagt, wird das Fettgewebe in einem Krebs-Ringer-Henseleit-Puffer inkubiert, der Kollagenase enthält, um die Gewebematrix zu stören. Schwimmende reife Adipozyten werden auf der Oberseite des Puffers gesammelt. Reife Zellen werden in einem T25-Kolben, der vollständig mit Medien gefüllt ist, plattiert und eine Woche lang kopfüber inkubiert. Ein alternativer 6-Well-Plattenkulturansatz ermöglicht die Charakterisierung von Adipozyten, die sich einer Dedifferenzierung unterziehen. Die Morphologie der Adipozyten ändert sich im Laufe der Zeit der Kultur drastisch. Die Immunfluoreszenz kann problemlos an Objektträgern durchgeführt werden, die in 6-Well-Platten kultiviert werden, wie die FABP4-Immunfluoreszenzfärbung zeigt. Das FABP4-Protein ist in reifen Adipozyten vorhanden, wird aber durch Dedifferenzierung der Fettzellen herunterreguliert. Die Dedifferenzierung reifer Adipozyten könnte einen neuen Weg für die Zelltherapie und das Tissue Engineering darstellen.
Einleitung
Die In-vitro-Dedifferenzierung reifer Adipozyten wird durch eine Technik namens Deckenkultur1 erreicht. Aufgrund ihrer natürlichen Tendenz, in wässrigen Lösungen zu schwimmen, haften isolierte reife Adipozyten an der Oberfläche eines umgedrehten Kolbens, der vollständig mit Kulturmedium gefüllt ist. Im Laufe weniger Tage verändern die Zellen ihre kugelförmige Morphologie und werden zu fibroblastenähnlichen Zellen. Die daraus resultierenden Zellen, die als dedifferenzierte Fettzellen (DFAT) bezeichnet werden, sind multipotent2. Forschungsartikel zur Dedifferenzierung von Adipozyten, insbesondere an menschlichen Zellen, sind begrenzt. Sie ....
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Protokoll
Ethics Statement: Das Projekt wurde von Forschungsethikkommission IUCPQ die vor der Rekrutierung von Patienten zugelassen. Für die Zwecke dieses Artikels / Video, erhalten wir Gewebe von 2 Patienten: 1) ein 62 Jahre alten männlichen Patienten mit einem BMI von 50,7 kg / m 2 und 2) eine 35-jährige Patientin mit einem BMI von 57 kg / m 2. Experimente können mit beiden Fettkompartimente geführt werden, sondern müssen eine Fettkammer für die Zwecke dieser Video beschränkt. Technische Aspekte der Video wurden mit Patienten-1 durchgeführt, und FABP4 Immunofluoreszenz wurde mit undifferenzierten Zellen von Patienten 2 durchgeführt.
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Ergebnisse
Wichtige morphologische Veränderungen auftreten, um Fettzellen während der Entdifferenzierung (Abbildung 1) zu reifen. Wie in Figur 2 gezeigt ist, wurden Zellen, die eine Dedifferenzierung mit einem Anti FABP4 Antikörper zur Fluoreszenz-Analyse gefärbt. Zellen mit einem runden Morphologie äußerte die FABP4 Protein, während die Mehrheit der Fibroblasten-ähnlichen Zellen nicht. Nach Entdifferenzierung kann DFAT Zellen mit Standardverfahren für mehrere Passagen kultiviert werden. Wir sind .......
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Diskussion
Entdifferenzierung von reifen Fettzellen mit der Decke Kulturtechnik ist ein neues Konzept für die Fettgewebestammzellen aus einer kleinen Probe von einheimischen Fettgewebe erhalten. Aufgrund unserer Erfahrungen und die der anderen 2 ist ein Gramm Gewebe ausreichend, um eine 25-cm 2-Kolben Platte und eine Bevölkerung von DFAT Zellen, für die Homogenität von Poloni und Mitarbeiter 3 gezeigt zu erhalten. Adipocyte Entdifferenzierung scheint mit Zellen von jedem Spender möglich, unabhängig.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.
Danksagungen
Diese Studie wurde unterstützt durch den Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (371697-2011, AT). Die Autoren möchten sich für die Hilfe der bariatrischen Chirurgen Dr. S. Biron, F-S. bedanken. Hould, S. Lebel, O. Lescelleur, P. Marceau sowie Christine Racine und Caroline Gagnon von der IUCPQ Tissue Bank. Wir danken Herrn Jacques Cadorette von den audiovisuellen Diensten der IUCPQ für die Videodreharbeiten und -bearbeitung.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Rinderserumalbumin | Sigma | A7906 | |
| Adenosin | Sigma | A4036 | |
| Ascorbinsäure | Sigma | A0278 | |
| NaCl | Jede Marke kann verwendet werden | ||
| KCl | Jede Marke kann verwendet werden | ||
| CaCl2 | Jede Marke kann verwendet werden | ||
| MgCl2 | Jede Marke kann verwendet werden | ||
| KH2PO4 | Jede Marke kann verwendet werden | ||
| HEPES | Jede Marke kann verwendet werden | ||
| Glukose | Jede Marke kann verwendet werden | ||
| Kollagenase Typ I | Worthington Biochemical Corp | LS-004196 | |
| DMEM/F-12, HEPES, kein Phenolrot | Gibco-Life Technologies | 11039-021 | Zu Medium hinzufügen : 20% Kälberserum, Gentamicin (50 &; Mikro; g/ml) und Fungizone (2,5 & Mikro; g/ml) |
| Kälberserum, Eisenzusatz, von mit Säuglingsnahrung gefütterten Kälbern | Sigma | C8056-500 ml | |
| 1/2 In Kunststoffbuchse | Iberville | 2704-CP | Artikelnummer:1000120918 (Home Depot) |
| Flüssiger Stickstoff | Linde | ||
| Formalin gelöster Stoff, neutral gepuffert, 10% | SIGMA | HT501128 | |
| Sterile Pinzette | |||
| Sterile Schere | |||
| 60 cc Spritzen | BD Spritze | ||
| Kunststoffschläuche | |||
| Krebs-Ringer-Henseleit Stammpuffer (KRH) | Stoffpuffer wie folgt vor: 25 mM HEPES pH 7,6, 125 mM NaCl, 3,73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2,5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein. | ||
| Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB) | Geben Sie die folgenden Komponenten frisch zum KRH-Puffer: 4% Rinderserumalbumin, 5 mM Glukose, 0,1 &; Mikro; M Adenosin, 560 & Mikro; M Ascorbinsäure | ||
| KRH-WB, ergänzt mit Kollagenase | 350 U/ml Kollagenase Typ I, | ||
| T25, unbelüftete Kappen-Gewebekulturflasche | Sarsted oder eine andere Marke | ||
| 6-Well-Gewebekulturplatte | BD Falcon oder eine andere Marke | ||
| Mikroskop-Deckglas 22x22 | Fisherbrand | 12-542-B | |
| Sterile Becher |
Referenzen
- Zhang, H. H., Kumar, S., Barnett, A. H., Eggo, M. C. Ceiling culture of mature human adipocytes: use in studies of adipocyte functions. J Endocrinol. 164 (2), 119-128 (2000).
- Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fa....
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Nachdrucke und Genehmigungen
