Summary
Nous présentons un système d'introduction de l'échantillon des gouttelettes discret pour couplage inductif spectrométrie de masse à plasma (ICP-MS). Il est basé sur une puce microfluidique pas cher et jetable qui génère des gouttelettes hautement monodisperses dans une gamme de taille de 40 à 60 um à des fréquences de 90 à 7000 Hz.
Abstract
Ce protocole traite de la fabrication et l'utilisation d'un faible coût puce microfluidique jetable système d'introduction d'échantillon pour couplage inductif spectrométrie de masse à plasma (ICP-MS). La puce produit monodisperses gouttelettes d'échantillon aqueux dans perfluorohexane (PFH). La taille et la fréquence des gouttelettes aqueuses peuvent varier dans l'intervalle de 40 à 60 um et de 90 à 7000 Hz, respectivement. Les gouttelettes sont éjectées à partir de la puce avec un deuxième flux de PFH et restent intactes lors de l'éjection. Un système de désolvatation sur mesure supprime la PFH et transporte les gouttelettes dans les ICP-MS. Ici, les signaux très stables avec une étroite répartition de l'intensité peut être mesurée, montrant la monodispersité des gouttelettes. Nous montrons que le système d'introduction peut être utilisé pour déterminer quantitativement le fer dans des cellules individuelles de globules rouges de bovin. Dans l'avenir, les capacités de l'appareil d'introduction peut être facilement étendu par l'intégration de modules microfluidiques supplémentaires.
Introduction
L'analyse élémentaire d'échantillons liquides par couplage inductif spectrométrie de masse à plasma (ICP-MS) est couramment effectué en utilisant des nébuliseurs, en combinaison avec des chambres de pulvérisation en tant que système d'introduction 1. Dans ce système d'introduction de l'échantillon, l'échantillon est pulvérisée par un nébuliseur pour produire un aérosol polydispersé. Une chambre de pulvérisation en aval est utilisé pour filtrer les grosses gouttelettes. Cette méthode est associée à une forte consommation de l'échantillon (> 0,3 ml min -1) 2 et un transport de l'échantillon incomplètes. Ainsi, il devient impossible pour les applications où des volumes d'échantillon ne microlitres sont disponibles, comme dans les études biologiques, légistes, toxicologiques et cliniques 3. Pour réduire la consommation de l'échantillon, nébuliseurs avec des dimensions de buses plus petites ont été développés 3. Cependant, la taille de la buse réduit augmente le risque de colmatage lorsque des échantillons de liquides biologiques non digérés ou des solutions salines concentrées doivent être analysés 3.
et al. 4. Les auteurs injecte un liquide dans ICPMS sous la forme de microgouttelettes discrètes, monodisperses qui ont été produites par une micropompe entraîné piézo-électrique. Même si ce système n'a pas trouvé très large application, l'ouverture de la poursuite du développement du concept de l'introduction discrète de gouttelettes dans ICPMS. Aujourd'hui, entraînée piézo-électrique, systèmes qui peuvent produire des gouttelettes de taille de 30, 50, 70 et 100 um et à des fréquences de 100-2,000 Hz distribution, peut être acheté. Les gouttelettes peuvent être transportés dans ICPMS avec près de 100% d'efficacité 5. Ces distributeurs de microgouttelettes ont été appliquées pour mesurer quantitativement nanoparticules simples 5,6 ainsi que la caractérisation des cellules biologiques individuelles 7. Un système similaire basé sur la technologie jet d'encre thermique 8 a été testé pour l'analyse des échantillons biologiques 9. Bien que le disposystèmes gouttelettes d'introduction simples lable sont très efficaces, peut être utilisé pour de petits volumes d'échantillon et sont prometteurs pour l'analyse de nanoparticules et de cellules, ils ont plusieurs limitations. Pour une taille fixe de la buse, la taille des gouttelettes peut varier que légèrement (à moins que des paramètres personnalisés sont utilisées 10). Les modifications des propriétés physiques du liquide (pH, teneur en sel) peuvent modifier les caractéristiques de gouttelettes (taille, vitesse d'injection). En outre, ces dispositifs sont assez coûteux, sujettes à encrassement et sont difficiles à nettoyer.
Un autre procédé pour générer des gouttelettes est connu dans le domaine de la microfluidique gouttelettes 11. Au cours des dernières années gouttelettes microfluidique a suscité un intérêt pour les (bio) réactions chimiques 12-15 et pour les études de cellules individuelles 16,17. De plus, cette technique a été appliquée pour l'introduction des échantillons dans la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation et 18,19 pour la préparation d'échantillons à laser assistée par matrice de désorption / ionization spectrométrie de masse 20,21.
Récemment, nous avons introduit un système de microfluidique pour l'échantillon introduction en ICP-MS 22. L'élément clé de notre système d'introduction est le liquide assistée éjection de gouttelettes (LADE) puce. Cette puce se compose entièrement de poly (diméthylsiloxane) (PDMS). Dans le premier canal de jonction se écouler mise au point est utilisé pour générer des gouttelettes monodispersées d'une solution aqueuse de l'échantillon (figure 1). A cet effet, le très volatile (point de 58-60 ° C 23 d'ébullition) et le transporteur non miscible phase de perfluorohexane (PFH) est utilisé (Figure 1). Ces propriétés permettent PFH une génération stable de gouttelettes et l'enlèvement rapide de la phase de la porteuse. Changements dans les propriétés de l'influence échantillon liquide cette méthode de génération moins, par rapport à d'autres générateurs de gouttelettes. La taille des gouttelettes est réglable sur une large gamme en modifiant le taux de la phase aqueuse et le flux PFH. Dans un SECONDAIRE avaly jonction, et plus PFH est ajouté pour augmenter la vitesse d'écoulement à au moins 1 m sec -1. A cette vitesse, le liquide peut être éjecté de la puce dans jet stable et droite (Figure 1) sans destruction de gouttelettes (Figure 1 encadré). Cette conception à double jonction permet de contrôler la stabilité de jet indépendante de la génération de gouttelettes. Les gouttelettes sont transportés vers les ICPMS avec un système de transport sur mesure. Ce système comprend un tube descendant et un desolvator à membrane pour éliminer la PFH. Les résidus secs des gouttelettes aqueuses sont ensuite ionisées dans le plasma de l'ICPMS et un détecteur mesure de masse des ions. La partie avant de la puce est d'assurer une liaison étanche avec le système de transport de gouttelettes en forme de tonneau. L'éjection de l'échantillon aqueux sous forme de gouttelettes dans PFH est bénéfique, parce que le contact avec la buse est évitée. Cela réduit considérablement le risque de bouchage des buses, ce qui peut être un problème lorsque l'on travaille avec des suspensions de cellules ou de codes solutions salines ncentrated. Les puces LADE, fabriqués par PDMS lithographie douce, ne coûtent pas cher (2 coût matériel d'environ $ par puce), jetable et facile à modifier. En combinaison avec la fabrication qui nécessite seulement une petite quantité de travail manuel chaque expérience peut être réalisée avec une nouvelle puce. Par conséquent, un nettoyage laborieux ne est pas nécessaire et la contamination croisée est minimisée.
Ici, la fabrication de la puce LADE par lithographie douce et son application pour ICPMS sont décrits. Des exemples de mesures avec une solution aqueuse et une suspension cellulaire sont présentées.
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Protocol
1. SU-8 de fabrication de Maître (Figure 2)
REMARQUE: Effectuer la fabrication des moules maîtres SU-8 dans une chambre propre pour prévenir les défauts causés par des particules de poussière. Deux plaquettes sont nécessaires pour la fabrication, une plaquette avec des fonctionnalités microfluidiques et l'autre sans.
- Préparer les moules de base pour la puce microfluidique. Appliquer d'abord une couche d'adhésion à la plaquette de silicium.
- Déshydrater une plaquette de silicium pendant 10 minutes à 200 ° C. Refroidir la plaquette à TA et le charger sur un manteau spin coucheuse et de spin avec SU-8 2002 avec le protocole suivant.
- Distribuer environ 3 ml résistent sur la plaquette.
- Faites tourner la plaquette à 500 rpm pendant 10 sec à répandre la résine sur toute la tranche.
- Faites tourner la tranche à 2000 tours par minute pendant 30 secondes pour atteindre une hauteur d'environ 2 résister um.
- Enlever l'excès de résister à partir du bord de la plaquette avec un tampon imbibé d'acétone, pour éviterle collage de la plaquette à la plaque chaude dans l'étape suivante. Cuire la plaquette pendant 60 secondes à 95 ° C sur une plaque chauffante.
- Exposer l'ensemble plaquette avec la lumière ultraviolette (80 mJ / cm 2 à 365 nm). Post-cuisson la plaquette pendant 120 secondes à 95 ° C.
- Refroidir la plaquette vers le bas et tourner immédiatement manteau la tranche à nouveau en utilisant le protocole suivant pour SU-8 2050:
- Faites tourner la plaquette à 100 tours par minute pendant 20 sec (dispense environ 3 ml SU-8 résister lors de cette étape).
- Faites tourner la plaquette à 500 rpm pendant 10 sec à répandre la résine sur toute la tranche.
- Tourner la tranche à 3250 tpm pendant 30 secondes conduisant à une épaisseur de l'ordre de résister à 40 um.
- Encore une fois, enlever l'excès de résister depuis le bord de la plaquette avec un tampon imbibé d'acétone et cuisson douce la plaquette sur une plaque chauffante pendant 180 secondes à 65 ° C et pour 360 s à 95 ° C.
- Préparer le photomasque par sticking à un verre sodo-calcique. Voir la figure 3 pour la conception de masque. Utilisation d'un dispositif d'alignement de masque pour exposer la résine photosensible avec une lumière ultraviolette (160 mJ / cm 2, mesurée à 365 nm) à travers le masque disposé. Cuire au four de la tranche exposée à nouveau sur une plaque chaude pendant 60 secondes à 65 ° C et pour 360 s à 95 ° C.
- Après refroidissement à la température ambiante de la plaquette, la plonger dans une boîte de Pétri en verre rempli de révélateur pendant 5 min à développer le résist. Agiter doucement la boîte de Pétri pour enlever non exposée SU-8. Rincer la tranche avec de l'isopropanol et souffler le sécher avec un pistolet d'azote.
- Examiner la plaquette sous un microscope. Dans le cas peu développée résister reste sur les caractéristiques, de développer la tranche à nouveau pendant quelques minutes, comme décrit dans l'étape 1.7.
- Éliminer tout solvant résiduel par cuisson des tranches pendant 2 heures à 200 ° C. Vérifiez la hauteur des caractéristiques avec un profileur de l'étape. En cas la hauteur mesurée diffère de la hauteur désirée commencer par ce protola col nouveau et d'adapter la vitesse d'essorage à l'étape 1.1.4.
- Pour éviter le collage des PDMS à silaniser la plaquette en la plaçant dans un dessiccateur avec 50 ul de 1 H, 1 H, H 2, H 2 -perfluorodecyltrichlorosilane dans une petite capsule de porcelaine. Réduire la pression dans le dessiccateur à 100 mbar et incuber la plaque pendant 12 heures.
- Pour les parties de PDMS blank silaniser autre tranche de silicium selon la méthode de l'étape 1.10. Pour enregistrer silaniser les deux tranches de temps en même temps dans un seul dessiccateur.
2. LADE Chip Fabrication
REMARQUE: La puce LADE est faite de deux PDMS pièces qui sont liées ensemble par collage 24. La première partie contient les caractéristiques microfluidiques. L'autre partie est plate et utilisée pour sceller les canaux. Collées ensemble, elles forment la forme ronde nécessaire pour interfacer la puce avec le système de transport des gouttelettes. Ici, la fabrication deles deux parties et leur liaison est décrite. Toutes les étapes du procédé sont présentés dans la figure 4.
- Préparez 44 g de PDMS par mélange de 40 g de prépolymère avec 4 g du PDMS agent de durcissement (cela se traduira par jusqu'à 6 copeaux). Dégazer les PDMS dans un dessiccateur jusqu'à ce qu'il soit exempt de bulles (cela prendra environ 20 min).
- Replica moulage des moitiés structurés.
- Placez la forme de coulée au-dessus de la plaquette et qu'elle se enclenche en place en utilisant les structures de guidage autour de la conception (voir figure 5). Passer le claquement en place pour le PDMS Halve plat.
- Verser environ 3 à 4 g de PDMS dégazé sous la forme de coulée et le placer pendant 6 min sur une plaque chaude à 150 ° C. Refroidir les PDMS durcis sous la forme de coulée et soulevez délicatement la forme de coulée plaquette aide d'une spatule.
- Afin d'éviter toute contamination des canaux microfluidiques couvrir le côté de la puce qui a été précédemment en contact with la plaquette avec du ruban adhésif. Soigneusement couper le ruban le long du bord de la partie pour enlever PDMS PDMS excédentaires.
- Pour fabriquer les PDMS plats moitiés Répétez les étapes mentionnées ci-dessus 2.2.1 à 2.2.3 avec la plaquette silanisé vide.
- Peel de la bande et percer des trous de raccordement de fluide dans les moitiés structurées avec un perforateur de biopsie. Protéger les structures avec du ruban pendant le stockage.
- Lier les parties PDMS ensemble par collage à l'aide des PDMS agent 24 de durcissement.
- Prenez une tranche de silicium non traité et tourner l'enduire de PDMS agent de durcissement pendant 30 secondes à 6000 tours par minute. Prenez la plaquette de la tournette.
- Retirer le ruban de les moitiés structurées et les placer avec les structures tournées vers le bas sur la tranche. Poussez doucement sur le dessus du PDMS pour éliminer les bulles d'air.
- Retirer le ruban de PDMS vierges moitiés. Jetez un Halve structuré de la plaquette et aligner manuellement sur le dessus du PDMS Halve plat. Pressez délicatement laséparer ensemble pour éliminer les bulles d'air et laisser le remède à puce assemblé pendant 24 heures à température ambiante. Ne poussez pas les pièces ensemble avec une force car cela peut causer des canaux se effondrer.
- Couper l'extrémité de la puce le long de la ligne de l'indicateur orthogonal au canal de buse avec un couteau pour ouvrir la buse de sortie. Utiliser un dispositif d'alignement pour assurer une coupe droite, qui est nécessaire pour une éjection de liquide directement. Inspectez le circuit sous un microscope pour les défauts dans les canaux microfluidiques et les particules de poussière. Mettez un ruban adhésif sur les trous d'entrée pour protéger les puces pendant le stockage.
- Connectez un flacon de Woulff avec des tubes à une source d'azote sec et de toutes les entrées de la puce LADE. Dépôt 50 pi de 1 H, 1 H, 2 H, 2 H -perfluorodecyltrichlorosilane au fond de la bouteille de Woulff et fermer.
- Silaniser les canaux microfluidiques par tous les canaux de rinçage pendant 20 minutes avec le courant d'azote portant 1 H, 1 H H 2, H 2 -perfluorodecyltrichlorosilane à un débit d'environ 1 ml / sec écoulement. Les puces sont prêts pour des expériences et peuvent être stockés pendant au moins plusieurs semaines à la température ambiante.
3. Préparatifs de Système de mesure / Droplet Transport
REMARQUE: Construire l'ensemble du système de transport de gouttelettes sur le dessus d'une table optique, car il est nécessaire de construire une structure de support stable pour l'installation. Un schéma de l'ensemble du système de transport de gouttelette est représenté sur la figure 6.
- Installez un poly cyclonique personnalisé (méthacrylate de méthyle) (PMMA) adaptateur avec un 50 cm tube en acier inoxydable attachés verticalement. Fixer l'adaptateur à une source d'hélium avec un contrôleur de débit massique. Joindre un (haut débit) caméra et une lampe à l'adaptateur sur les sites opposées pour la visualisation gouttelettes.
- Placer une cartouche chauffante dans le milieu du tube en acier et en utilisant le poly (chlorure de vinyle) (PVC) et un tube tubes LegrisConnecteur pour connecter l'extrémité du tube d'acier à l'entrée de la desolvator de la membrane.
- Raccorder la sortie du desolvator avec un autre tube en PVC à un adaptateur à écoulement laminaire qui est reliée directement à l'entrée ICPMS. Branchez l'adaptateur d'écoulement laminaire à une source d'argon avec un contrôleur de débit massique et plus tard l'utiliser pour mélanger Argon pour atteindre un état de fonctionnement stable.
- Alignez l'adaptateur ainsi que le tube d'acier verticale avec un niveau à bulle. Si l'alignement ne est pas exacte, elle peut entraîner des pertes importantes de gouttelettes. Insérez une fiche dans l'adaptateur pour empêcher les gaz se échapper pendant le système temps de préchauffage.
- Lancer flux et appareils utilisant les paramètres du tableau 1 gaz tous les mentionnés ci-dessus. Laisser le système se réchauffer pendant 15 min. La cartouche chauffante doit 2 heures pour stabiliser la température, allumez-le à l'avance.
- Placez les pompes à seringues sur une grille à la hauteur de l'adaptateur d'hélium cyclonique. Gardez la distance entre lepompes à seringue et l'adaptateur le plus court possible.
4. Mesures
REMARQUE: Le protocole suivant est écrit d'une manière générale en raison de la variété des solutions et des suspensions qui peuvent être utilisés. Toutefois, les suspensions cellulaires sont dilués à une concentration de <1 x 10 7 cellules / ml, lorsque l'analyse de cellules uniques est réalisée, afin de se assurer que la majorité des gouttelettes effectuer seulement une cellule. Pour des mesures avec des cellules placer les pompes à seringue à un angle de sorte que la sortie des seringues pointe en bas et d'installer la tubulure de manière à ce qu'ils pointent vers le bas.
- Fixer le tube aux seringues. Charge deux seringues de 5 ml avec le perfluorohexane et une seringue de 1 ml avec une solution d'échantillon ou de la suspension. Retirez toutes les bulles emprisonnées dans les seringues et les tubes.
- Installez les seringues dans une pompe de seringue et de les relier aux entrées de la puce. Démarrez les pompes à seringues en utilisant les paramètres de démarrage deTableau 1 (ou des débits plus élevés). Donner les flux 3-5 min à stabiliser.
- Retirer l'excès de liquide de la pointe de la puce avec un mouchoir. Les liquides devraient maintenant éjecter de la puce dans un jet droit. Si une éjection rectiligne ne peut être atteint en l'essuyant avec un tissu de remplacer la puce et recommencer avec cette étape.
- Retirez le bouchon de l'adaptateur et insérer délicatement la puce dans l'adaptateur. Graisser la puce avec le FC-40 si nécessaire. Une puce peut être utilisée pour au moins 2 heures d'expériences.
- Changer le débit d'être dans les paramètres de mesure recommandées du tableau 1. Débit inférieur de la PFH permet non seulement PFH mais réduit également fond de signal, causés par des interférences isobariques.
- Donnez le système 2-5 min à stabiliser (en fonction des débits choisis). Optimiser les ICPMS pour l'intensité de signal le plus élevé des analytes d'intérêt.
- Régler successivement les flux de tous les gAses sur les contrôleurs de débit massique (voir les plages recommandées dans le tableau 1) jusqu'à ce que l'intensité maximale du signal des analytes d'intérêt est atteint. Accordez la puissance du plasma et les tensions de lentilles de focalisation (selon les gammes recommandées par le fabricant) sur les ICP-MS de la même façon.
- Définissez les ICPMS à un temps de séjour de 10 ms (appliquée pour les ICPMS mêmes utilisés, mais peut être ajustée avec d'autres instruments pour assurer une acquisition en temps résolu). Commencer à enregistrer le signal d'un m / z particulier en utilisant le protocole du fabricant.
- Après la mesure, transférer les données brutes à programme d'analyse de données pour l'évaluation. Bin données, compte tenu en coups par 10 ms, avec un haut-fonction, et l'intrigue valeurs centrales bin résultant contre les chefs d'accusation. Monter chaque pic dans l'histogramme de distribution de fréquence comploté avec une fonction de Gauss. La moyenne et sigma de l'ajustement représentent l'intensité du signal moyen et son écart type, respectivement.
- Mesurer une solution unique ou une norme multi-éléments contenant le ou les éléments d'intérêt aux mêmes débits que l'échantillon.
- Placez une puce LADE dans une boîte de Pétri sur un microscope. Pour une meilleure qualité d'image utiliser une puce non ronde. Fabriquer cette puce comme décrit dans l'étape 2, mais en utilisant un simple formulaire de coulée rectangulaire au lieu d'une forme partiellement ronde.
- Suivez les étapes 4.1 à 4.2.1 pour lancer la génération de gouttelettes. Définissez les débits aux débits utilisés dans l'étape 5.1.
- Enregistrez les images des gouttelettes aqueuses avec une caméra haute vitesse attaché à un microscope (objectif 20X). Utiliser un logiciel d'analyse d'image comme le morphométrie des gouttelettes et des logiciels de vélocimétrie par Basu 25 pour obtenir le diamètre moyen des gouttelettes à partir des enregistrements.
- Utilisation diamètre de gouttelette moyen de calculer le volume de la gouttelette, en supposant que la gouttelette est un objet sphérique.
- De ce volume et l'knpropre concentration d'un analyte dans la gouttelette calculer le nombre d'atomes correspondant. Diviser le nombre d'ions mesurées par gouttelettes par le nombre d'atomes d'obtenir l'efficacité de détection. Utiliser cette efficacité de détection pour calculer le nombre d'atomes dans un échantillon inconnu.
NOTE: Depuis les variations entre les puces individuelles sont petites 22, il ne est pas nécessaire de répéter la mesure de la taille des gouttelettes pour chaque puce ou une solution si les débits restent les mêmes. Une liste des amplitudes et des fréquences gouttelettes selon les débits spécifiques est publié par Verboket et al. 22.
- De ce volume et l'knpropre concentration d'un analyte dans la gouttelette calculer le nombre d'atomes correspondant. Diviser le nombre d'ions mesurées par gouttelettes par le nombre d'atomes d'obtenir l'efficacité de détection. Utiliser cette efficacité de détection pour calculer le nombre d'atomes dans un échantillon inconnu.
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Representative Results
Le système présenté peut être utilisé pour mesurer de petits volumes de solutions ou de suspensions contenant des cellules ou des nanoparticules. Des exemples d'une mesure d'une solution standard et la caractérisation des cellules individuelles sont montrés ici. D'autres exemples peuvent être trouvés dans Verboket et al. 22.
Typiquement, le signal d'une seule goutte d'une solution est un événement très court. Il dure généralement quelques 100 ps 26. Avec les ICPMS utilisées ici (temporisation 10 ms) signaux courts comme ceux-ci ne peuvent pas être résolus temporellement. Figure 7a et 7b Figure montrent les signaux et distribution de fréquence histogramme d'une solution standard Na. Les gouttelettes arrivent au plasma avec une gigue> 10 msec temporelle. La détection ne est pas synchronisé. Les signaux de l'un (201 ± 24), deux (381 ± 34) ou trois (560 ± 45) sont détectés à l'intérieur des gouttelettes une durée de temporisation. Faible variation de l'intensité du signal suggère haute dromonodispersité Plet. Le premier pic de résidus est probablement le résultat de fragments de gouttelettes; la cause de cette fragmentation est toujours sous enquête.
L'approche d'étalonnage décrite en 5 (en utilisant Fe solution standard) a été testé pour la détermination de la teneur de Fe seule bovine / mollet globules rouges (6-7 m de diamètre) en suspension dans un tampon phosphate salin (PBS). La suspension de 1 x 10 7 cellules ml -1 a été utilisé pour se assurer que la majorité des gouttelettes effectuer seulement une cellule. La figure 8 montre les signaux provenant de cellules que la distribution de fréquence histogramme. En moyenne chaque cellule contenait 5,3 ± 1,2 x 10 8 atomes de Fe (voir Verboket et al. 22).
Figure 1. Micrographie de génération de gouttelettes, l'accélération et l'éjection. Dans un Junct flux concentrantion, gouttelettes aqueuses monodisperses sont générés dans le courant de PFH. PFH supplémentaire est ajoutée à une deuxième jonction. Par la suite, le courant de liquide est éjecté de la puce LADE à travers une buse. Les flèches indiquent la direction de l'écoulement. La barre d'échelle est de 500 um. En médaillon: Micrographie d'une gouttelette aqueuse dans une coquille PFH après l'éjection de la puce LADE. Barre d'échelle de 100 um. Adapté avec la permission de 22. Droit d'auteur 2014 American Chemical Society. Ce chiffre a été modifié avec les données de recherches menées depuis la publication dans le laboratoire du PS Dittrich. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Représentation schématique de la transformation SU-8. Tout d'abord une couche d'adhérence est appliquée. Une tranche de silicium est de spinrevêtue de SU-8 2002, doux cuit, inondation exposée à la lumière ultraviolette et post cuit. En plus de cette couche les structures microfluidiques sont produites. La plaquette est appliquée par centrifugation avec SU-8 2050 et cuite doucement. La conception des structures microfluidiques est transférée à la tranche par exposition à la lumière ultraviolette à travers un masque photographique. Après une cuisson post-exposition, la résine photosensible est développé et un hardbake est effectuée. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Conception du photomasque pour la puce LADE contenant les caractéristiques suivantes: structures a) directeurs pour la forme de coulée, b) une entrée pour le PFH pour l'accélération de gouttelettes, c) une entrée pour PFH pour la production de gouttelettes et d) une entrée pour l'échantillon aqueux.e) ligne de l'indicateur pour couper la pointe de la puce. largeurs de canal f) = 40 um, g) = 20 um et h) = 25 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. diagramme de processus de la fabrication de puces LADE. D'abord le structuré et les PDMS plats pièces sont fabriquées par moulage réplique. Les deux pièces sont reliées entre elles par collage. Enfin, la pointe de la puce est coupée et les canaux microfluidiques sont silanisée. Adapté avec la permission de 22. Droit d'auteur 2014 American Chemical Society. Ce chiffre a été modifié depuis la publication. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version agrandie de ce chiffre.
Figure 5. de dessin technique de la forme de moulage d'aluminium pour la puce LADE. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Schéma de l'installation (pas à l'échelle). Le système se compose de la puce LADE, un adaptateur cyclonique, un tube d'acier chauffée, un desolvator de la membrane et un ICPMS. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .
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Figure 7. (A) Signaux de gouttelettes fabriqués à partir d'un 1 mg kg -1 solution standard Na. (B) Distribution de fréquence histogramme de ces signaux. Dans les 10 ms habiter signaux de temps d'un (jaune), deux (rouge) ou trois (bleu) gouttelettes ont été enregistrés. La moyenne et l'écart type des signaux ont été déterminées par des fonctions gaussiennes de montage. Les débits utilisés étaient de 0,5, 50 et 60 pi min - 1 de l'échantillon aqueux, PFH pour la production de gouttelettes et PFH pour l'accélération de gouttelettes, respectivement. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 8. Fréquence histogramme de répartition de 56 Fe + signale geégalement exonéré par les globules rouges. La moyenne et l'écart type des signaux ont été déterminées en ajustant une fonction gaussienne. Les débits utilisés étaient 2, 80, et 80 ul min - 1 de suspension de cellules, PFH pour la génération de gouttelettes, et PFH pour l'accélération de gouttelette, respectivement.
| Débit de gaz He | 0,6-0,8 L min -1 | |
| Cartouche chauffante | 30 W | |
| Desolvator température de la membrane | 160 ° C | |
| débit de gaz de balayage de Desolvator | 3-4 L min -1 | |
| Débit de gaz Ar | 0,1 L min -1 | |
| ICP puissance du plasma | 1300 W | |
| Débit échantillon | commencez | 1 ul min -1 |
| mesures | De 0,3 à 15 pi min -1 | |
| taux de PFH génération de gouttelettes de débit | commencez | 60 ul min -1 |
| mesures | 35-80 min ul -1 | |
| taux d'accélération de gouttelettes PFH Flow | commencez | 60 ul min -1 |
| mesures | 35-80 min ul -1 |
Tableau 1. Paramètres de démarrage et a recommandé paramètres de mesure pour les ICP-MS et les pompes à seringues.
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Discussion
Bien que la fabrication des puces est très sûre, il ya certains points critiques au cours de la fabrication qui requièrent une attention particulière. Tout d'abord, la propreté pendant le montage est très important pour éviter la contamination de la puce par la poussière. La poussière peut bloquer les canaux et prévenir une génération de gouttelettes stable. Deuxièmement, il est particulièrement important que la pointe est coupée orthogonal au canal de buse. L'angle de la coupe influence fortement l'angle d'éjection. Si le liquide est éjecté en formant un angle, il peut entraîner une perte de gouttelettes éjectées.
Lors de la construction de l'installation se assurer qu'elle est stable. L'alignement vertical du tube de métal et l'adaptateur sont importants. Aussi pendant les mesures il ya quelques points qui nécessitent une attention particulière. L'insertion de la puce dans l'adaptateur doit être effectuée avec soin. Il peut arriver que lors de l'insertion du jet est perturbé et se arrête. Pour les mesures avec des cellules de la position et orientation des pompes à seringues et des tubes sont importantes. Leur mise en place correcte peut réduire la sédimentation des cellules dans la seringue et le tube.
La puce LADE présentée ici a plusieurs avantages sur générateurs commerciaux existants de gouttelettes. Le système est plus robuste, offre une gamme de taille de gouttelette plus large, qui peut être encore prolongée par modification de la géométrie du canal, et est jetable. Un dispositif à usage unique est d'un intérêt particulier pour l'analyse des échantillons à haute teneur de sels ou résidus solides, comme par exemple des nanoparticules ou de suspensions cellulaires, qui peuvent obstruer les canaux minuscules et ne peuvent pas toujours être facilement emportées. Le transport de microgouttelettes simples générées par la LADE dans le MS est encore une étape limitante dans notre système et doit être optimisé. L'ensemble de transport de gouttelettes actuelle, bien supprime la vapeur PFH, qui, autrement, créer des interférences spectrales et non spectrales et provoquer des instabilités du plasma, mais still résultats dans un gigue temporelle des gouttelettes arrivée à la MS et un transport de gouttelettes incomplètes. En comparaison avec les systèmes disponibles gouttelettes d'introduction commerciale du système de transport pour cette configuration nécessite plus d'équipement. La puce actuel est conçu pour l'introduction de l'échantillon seulement. Cependant, avec de légères modifications de la conception et l'introduction avancée préparation des échantillons steps nuage être mis en œuvre sur puce, par exemple, la dilution 27-29, mélange rapide 30, les réactions chimiques ultra 31, 32-34 séparation ou tri cellulaire 35,36. Sous dispositifs d'introduction avancées nous comprenons par exemple l'introduction de l'échantillon et standards gouttelettes successivement ou parallèlement à une seule puce. Cela augmenterait le débit et améliorer la précision de l'analyse quantitative.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon wafer 100 mm | Si-Mat (Kaufering, Germany) | ||
| SU-8 2002 | Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| SU-8 2050 | Microchem Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Acetone | Merk VWR (Darmstadt, Germany) | 100014 | |
| MR-developer 600 | Microresist Technology GmbH (Berlin, Germany) | ||
| Isopropanol | Merk VWR (Darmstadt, Germany) | 109634 | |
| 1H,1H,2H,2H-perfluorodecyltrichlorosilane | ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) | AB111155 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit (PDMS) | Dow Corning (Michigan, U.S.A.) | 39100000 | |
| Perfluorohexane 99% | Sigma-Aldrich (Missouri, U.S.A.) | 281042 | |
| FC-40 | ABCR-Chemicals (Karlsruhe, Germany) | AB103511 | |
| Phosphate-buffered saline | Life Technologies (Paisley, U.K.) | 10010-015 | |
| Red blood cells in phosphate-buffered saline | Rockland Immunochemicals Inc. (Pennsylvania, U.S.A.) | R400-0100 | |
| Single-element standard solutions Na, Fe | Inorganic Ventures (Virginia, U.S.A.) | ||
| Multielement standard solution | Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.) | IV | |
| Nitric acid | Sub-boiled | ||
| Ultrahigh-purity water | Merck Millipore (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Hot plate HP 160 III BM | Sawatec (Sax, Switzerland) | used for wafer preparation | |
| Spin modules SM 180 BM | Sawatec (Sax, Switzerland) | used for wafer preparation | |
| High resolution film photomask | Microlitho (Essex, U.K.) | ||
| Step profiler Dektak XT advanced | Bruker (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Hot plate MR 3002 | Heidolph (Schwabach, Germany) | used for replica molding | |
| 1.5 mm biopsy puncher | Miltex (Pennsylvania, U.S.A.) | 33-31AA/33-31A | |
| Spin coater WS-400 BZ-6NPP/LITE | Laurell (Pennsylvania, U.S.A.) | used for adhesive bonding | |
| Syringe pump neMESYS | Cetoni (Korbussen, Germany) | ||
| 1 ml syringe | Codan (Lensahn, Germany) | 62.1002 | |
| 5 ml syringe | B. Braun (Melsungen, Germany) | 4606051V | |
| PTFE tubing | PKM SA (Lyss, Switzerland) | PTFE-AWG-TFT20.N | |
| Quadrupole-based ICPMS ELAN6000 | PerkinElmer (Massachusetts, U.S.A.) | ||
| Membrane desolvator CETAC6000AT+ | CETAC Technologies (Nebraska, U.S.A.) | only the desolvator unit is used | |
| High speed camera Miro M110 | Vision Research (New Jersey, U.S.A.) | ||
| Data analysis program Origin pro | OriginLab Corp. (Massachusetts, U.S.A.) | version 8.6 | |
| Microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | IX71 |
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