Verfahren zur Kultivierung humaner Femur Gewebeexplantaten an Brustkrebs Zellbesiedlung des metastasierten Niche Studieren

Summary

Protokolle für die Untersuchung Brustkrebs-Zellmigration, Proliferation und Kolonisierung in menschlichen Knochengewebe Explantation Modellsystem beschrieben.

Abstract

Bone ist die häufigste Stelle der Metastasierung von Brustkrebs. Obwohl es allgemein, dass der Mikro Einflüsse Krebszellverhalten akzeptiert wird, wird wenig über Brustkrebszell Eigenschaften und Verhaltensweisen in der nativen Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe bekannt. Wir haben Ansätze zu verfolgen, zu quantifizieren und zu modulieren menschlichen Brustkrebszellen in der Mikroumgebung des entwickelten kultivierten menschlichen Knochengewebefragmenten aus gebrauchten Femurköpfe nach Hüft-TEP Operationen isoliert. Verwendung Brustkrebszellen für Luciferase konstruiert und verstärkt grün fluoreszierende Protein (EGFP) Expression sind wir in der Lage, reproduzierbar zu quantifizieren Migration und Proliferation Muster mit Biolumineszenz-Bildgebung (BLI), Spur Zell-Wechselwirkungen innerhalb der Knochenfragmente mittels Fluoreszenzmikroskopie und auszuwerten Brustzellen nach Besiedlung mit Durchflusszytometrie. Die wichtigsten Vorteile dieses Modells sind: 1) eine native, architektonisch intaktem Gewebe MicroEnvironment relevanten Zelltypen des Menschen beinhaltet, und 2) direkten Zugriff auf die Mikroumgebung, die eine schnelle quantitative und qualitative Überwachung und Störung der Brust und Knochenzelleigenschaften, Verhaltensweisen und Interaktionen ermöglicht. Eine Haupteinschränkung, derzeit ist die finite Lebensfähigkeit der Gewebefragmente, die das Fenster der Studie, um Kurzzeitkultur beschränkt. Anwendungen des Modellsystems umfassen die Untersuchung der Grundlagen der Biologie von Brustkrebs und anderen Knochensuchmalignomen in der metastatischen Nische, und die Entwicklung therapeutischer Strategien zur zielgerichteter Brustkrebszellen in Knochengewebe.

Introduction

Die Tumor-Mikroumgebung wird weithin als ein kritischer Faktor für die Krebszelle Verhalten bei Brustkrebs Progression und Metastasen erkannt verteilt ^1-3. Das Ziel der hier vorgestellten Verfahren ist die Untersuchung von Brustkrebs-Zellen in der Mikroumgebung des menschlichen Knochengewebe, die häufigste Stelle der Brustkrebsmetastase ^4-6 erleichtern. Knochen von mineralisierten und Mark Fächer ^7-9, die beide beherbergen Zellen sezerniert Faktoren bei metastasierendem Progression ^10,11 verwickelt zusammen. Obwohl weit verbreitet in vivo Mausmodellen zu erleichtern systemische Studien des metastatischen Prozesses ....

Protocol

Kugelköpfe wurden von Patienten nach elektiven THR Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Alle Gewebe wurden als de-identifizierte Proben in Übereinstimmung mit den Vorschriften der Stanford University Research Compliance Office gesammelt.

1. Auswählen einer Brustkrebszelllinie (n)

1. Erhalten oder Transfektion die gewünschte Brustkrebszelllinie (n) mit einem Luciferase-GFP-Reporterkonstrukt. Die folgenden Versuche wurden durch Transfektion mit dem Transposon Sleeping Beauty Plasmid PKT2 / Lubig unter Verwendung der MDA-MB-231 und MCF-7 Brustkrebs-Zelllinien für die stab....

Results

Isolieren von Gewebefragmenten aus Hüftköpfe

Kugelköpfe wurden aus einer gleichen Anzahl von männlichen und weiblichen Patienten (44-90 Jahre) nach elektiven Hüft-Chirurgie in der Abteilung für Orthopädische Chirurgie an der Stanford University School of Medicine gesammelt. Jedes verworfen Hüftkopf enthält einen kleinen Teil des oberen Oberschenkel, die trabekuläre Knochengewebe des mineralisierten Nadeln und Mark zusammen birgt. Dieses Gewebe ist durch die chirurgisch freiQuerSchnitt der We.......

Discussion

Mehra et al. Wurden bereits beschrieben die Obduktion Sammlung und Analyse von Knochenproben von metastasierendem Prostatakrebs-Patienten zum Zeitpunkt der Autopsie entnommen und enthüllt hochwertigen Gewebe und Validierung der Verwendung von menschlichen Knochenproben, um die metastatischen Prozess ⁴⁷ zu studieren. Hier haben wir Protokolle zur Erhebung, Verarbeitung und Nutzung von menschlichen verworfen Femurköpfe folgenden THR Operation in einer kurzfristigen Co-Kultursystem, um Brustzellmigratio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Ergänzen Sie alle DMEM mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)	Life Technologies	16600-082	Ergänzen Sie alle McCoy's mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Pen/Strep
Fetales Rinderserum	Life Technologies	16000-044
Penicillen Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)	InvivoGen	ant-bl	Ergänzungsmedium für transfizierte Zelllinien.
Falke® Zellkultureinsätze für 24-Well-Platten mit transparenter PET-Membran (8,0 μ m Porengröße)	Corning Incorporated	353097
Falcon® 24 Well TC-behandelter Polystyrol-Zellkultureinsatz Companion Plate	Corning Incorporated	353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *für Säugetierzellen*	Invitrogen Detection Technologies	L-3224
FluoroBrite DMEM	Life Technologies	A18967-01
D-Luciferin Glühwürmchen, Kaliumsalz 5 g (30 mg/ml)	Life Technologies	L-8220
Steriles Zellsieb 70 μmu; m	Fisher Scientific	22363548
6-Well-TC-behandelter Zellkultur-Cluster	Corning Incorporated	3516
12-Well-TC-behandelter Zellkultur-Cluster	Corning Incorporated	3513
24-Well-TC-behandelter Zellkultur-Cluster	Corning Incorporated	3526
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Knochenwachs	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Bildgebungsplattform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software-Programm	Caliper Life Sciences/PerkinElmer	133026
EVOS FL Imaging System	Life Technologies	Version 4.2
OsteoSense 680 EX	PerkinElmer	NEV10020EX
MCF-7 Brustkrebszellen	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 Brustkrebszellen	ATCC	HTB-26
Monoklonales Maus-Anti-Human-Cytokeratin Antikörper	DAKO Cytomation	Clone (AE1/AE3)