This protocol describes how to generate a Drosophila S2 cell line that is sensitive to small molecule inhibitors of kinesin-5. The use of these cells in a cell-based error correction assay is also outlined.
Kinetochores are large protein-based structures that assemble on centromeres during cell division and link chromosomes to spindle microtubules. Proper distribution of the genetic material requires that sister kinetochores on every chromosome become bioriented by attaching to microtubules from opposite spindle poles before progressing into anaphase. However, erroneous, non-bioriented attachment states are common and cellular pathways exist to both detect and correct such attachments during cell division. The process by which improper kinetochore-microtubule interactions are destabilized is referred to as error correction. To study error correction in living cells, incorrect attachments are purposely generated via chemical inhibition of kinesin-5 motor, which leads to monopolar spindle assembly, and the transition from mal-orientation to biorientation is observed following drug washout. The large number of chromosomes in many model tissue culture cell types poses a challenge in observing individual error correction events. Drosophila S2 cells are better subjects for such studies as they possess as few as 4 pairs of chromosomes. However, small molecule kinesin-5 inhibitors are ineffective against Drosophila kinesin-5 (Klp61F). Here we describe how to build a Drosophila cell line that effectively replaces Klp61F with human kinesin-5, which renders the cells sensitive to pharmacological inhibition of the motor and suitable for use in the cell-based error correction assay.
הפרדה שווה של הגנום בעת חלוקת תא דורשת אינטראקציות נכונות בין microtubules DNA והציר המשוכפל. Microtubules אינטראקציה פיזי עם הכרומוזומים באמצעות הרכב של חלבונים שמרכיב בcentromeres הידוע כkinetochore 1. הפצה נכונה של הכרומוזומים דורשת שkinetochores אחותם bioriented, שבו כל אחות קשורה microtubules מקורם קטבי ציר הפוכים. microtubule Kinetochore (KT-MT) קבצים מצורפים שאינם בקונפורמציה bioriented הם ערערו במהירות וביעילות כדי לספק את ההזדמנות להקים biorientation בתהליך המכונה תיקון שגיאות. Assay תיקון שגיאות שהוקם בעבר בתאי יונקים 5 דורש הרכבת צירים monopolar באמצעות מעכבי מולקולה קטנים הפיכים נגד Eg5 (kinesin-5). הטיפול התרופתי מייצר שפע של קבצים מצורפים syntelic שגויים שבבוטkinetochores אחות h לצרף לאותו מוט הציר. כישלון הבא של התרופה מאפשר להדמיה של תהליך תיקון השגיאות. Assay תיקון שגיאות יכול להיעשות בנוכחות של מעכבי מולקולה קטנים או knockdowns ללמוד את התרומה של חלבוני מועמד לתיקון קבצים מצורפים KT-MT שגויים.
היכולת לדמיין תיקון שגיאות בתאים חיים היא כלי רב עוצמה כדי להבין את המנגנון המולקולרי מעורב בתהליך מורכב זה עוד יותר. עם זאת, המספר הגדול של כרומוזומים קיימים ברוב שורות תאים מציב אתגר בהתבוננות קבצים מצורפים KT-MT בודדים. תאי תסיסנית S2 יהיו אידיאליים ליישום assay תיקון שגיאות כפי שהם מכילים כמה כמו 4 כרומוזומים 6, אבל מעכבי מולקולה קטנים של kinesin 5 כגון S-trityl-L-ציסטאין (STLC) וmonastrol 7-9 אינו משפיע על הרכבה ציר או kinesin-5 תפקוד מוטורי בתאי תסיסנית. לכן אנו generaטד שורת תאי תסיסנית S2 להביע kinesin-5 האדם תחת אמרגן מושרה שהוא רגיש לkinesin-5 מעכבים. פרוטוקול זה מתאר כיצד מציאה homologue תסיסנית kinesin-5 אנדוגני, Klp61F, ולהשתמש בקו זה התא בassay תיקון שגיאות מבוססי התאים.
חזותי תיקון שגיאות היא טכניקה רבת ערך כדי ללמוד את הצעדים כרוכים בתהליך תאי חשוב ומורכב זו. לשם כך, קבצים מצורפים שגויים נוצרים באמצעות מעכבים הפיכים, ותיקון שגיאות נצפה על כישלון של התרופה. assay זה היה במקור פותח באמצעות תאים בתרבית רקמת יונקים 5. עם זאת נוכחותם של מספר הגדול של kinetochores בסוגים רבים של תאי יונקים מודל מציבה אתגר בהתבוננות אירועי תיקון שגיאות בודדים. תאי תסיסנית S2 יש כמה כמו 4 זוגות של kinetochores, מה שהופך אותם שורת תאים עדיפה יותר להתבוננות תיקון שגיאות. עם זאת, חסרון עיקרי הוא שמעכבים רבים אינם יעילים בתאי תסיסנית S2. לפיכך, את היכולת ליצור שורת תאי תסיסנית S2 אנושית להביע kinesin-5 אנושיים מספקת כלי רב ערך כדי ללמוד תיקון שגיאות.
למרות שתאי תסיסנית S2 יכולים להיותשורת תאים טובה יותר ללמוד תיקון שגיאות, השלבים המרובים הכרוכים בהשגת שורת התאים ודריסת גנים חיוניים מציבה כמה אתגרים לטכניקה זו. לדוגמא, יעילות transfection יכולה להיות נמוכה למדי. אם פחות מ -20% מהתאים המבטאים את Eg5-mCherry, transfection יש לחזור כתהליך הבחירה ייקח זמן רב יותר. כמו כן, אחוז תאי המבטאים שני חלבוני הניאון עלול להפחית לאורך זמן. זה ניתן להתגבר על ידי פיצול תאים בנוכחות Blasticidin S HCl וhygromycin B כדי לבחור עבור תאים לבטא Eg5-mCherry וGFP-α-טובולין, בהתאמה. כמו כן, חשוב לשים לב שיש לי תאי תסיסנית S2 orthologues לחלבונים רבים ואנושיים; לכן, זה קריטי, כדי לייעל את התנאים למציאת החלבונים אנדוגניים. תנאי מציאה אופטימליים עשויים להשתנות בסך של dsRNA ומשך טיפול. בהתחשב בהופעתה והשיפור המהיר של CRISPR-Cas9 Technologies 15-17, דור של שורת תאי תסיסנית עם גן Klp61F הוחלף על ידי Eg5 אדם מציג חלופה רבת עוצמה שהיה להתגבר על המגבלות של transfection וגישת מציאה. העבודה שלנו מוכיחה כי לטוס לאדם החלפת גן צריך להיות אפשרות מעשית במקרה זה למרות שהחומרים כימיים הדרושים כדי לעשות זאת בתאי תסיסנית S2 כרגע בשלבי פיתוח.
הליך זה אינו מוגבל לEg5, אבל יכול להיות מיושם ללמוד את הפונקציה של חלבונים אחרים בעלי עניין. אם באמצעות מעכבים שהעבר הוקם כדי להיות יעיל בתאי תסיסנית S2, פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי ללמוד את ההשפעה הישירה של מעכבים בתאים חיים חששות לגבי השפעות היעד בלי. שורת התאים הופקה באמצעות פרוטוקול זה יכול לשמש גם בהקרנת תפוקה גבוהה מנתח לזהות תרופות פוטנציאליות מיקוד חלבונים מעורבים בתיקון שגיאות.
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות לפטרישיה Wadsworth על המתנה של מבנה kinesin-5. עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH (5 R01 GM107026) לTJM ועל ידי מענק מחקר מס '5-FY13-205 מהמצעד הפרוטות קרן לTJM, כמו גם תמיכה מקרן צ'רלס ה' הוד, Inc, בוסטון, מסצ'וסטס. לTJM
Effectine Transfection Reagent | Qiagen | 301425 | |
Klp61F cDNA | Drosophila Genomic Resource Center | 13690 | Gene Name LD15641 |
Schneider’s Media | Invitrogen | 21720-024 | |
Fetal Bovine Serum, certified | Invitrogen | 10082-147 | Heat Inactivated, US origin |
Copper (II) Sulfate (CuSO4) | Sigma | C8027-500G | 500mM stock |
S-trityl-l-cysteine | Sigma | 164739-5G | 1mM stock in DMSO |
Blasticidin HCl | Invitrogen | R21001 | 5mg/ml stock in 1x PBS |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687010 | |
T7 Large scale RNA Production System | Promega | P1320 | The approximate dsRNA concentration from each reaction is about 5-15µg/µl |
Klp61F RNAi F primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGTA-TTTGCGCATTATTTTAAAA | |
Klp61F RNAi R primer | Invitrogen | TAATACGACTCACTATAGGGAT-ATTGATCAATTGAAAC | |
PCR clean-up kit | Mo Bio Laboratories, Inc | 1250 | |
Concanavalin A | Sigma | C5275 | 0.5mg/ml solution made by dissolving in 1xPBS. |
Boiled Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Labs | 017-000-121 | 5% stock solution in 1X PHEM buffer, bring solution up to boil. Stored in 4°C. |
Mounting Media | 20mM Tris pH 8.0, 0.5% N-propyl gallate, 90% Glycerol. Stored in 4°C | ||
1x BRB-80 | 80 mM PIPES pH 6.9; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2 | ||
White Light Source | Lumencor Inc | ||
ET EGFP Filter Cube | Chroma | 49002 | |
DSRed Filter Cube | Chroma | 49005 | |
anti-NDC80 antibody | Custom made by the Maresca Lab | ||
DM1α (anti-α-tubulin) | Sigma | T6199 | |
anti-CID antibody | AbCam | ab10887 |