Die dreidimensionale Kultur in Alginatkügelchen wurde aufgrund ihrer Einfachheit und Reproduzierbarkeit ausgewählt, um die Hypophysenadenomzellen zu erhalten. Die Verfahren umfassten einen initialen enzymatischen Verdau und eine mechanische Dissoziation des Tumorgewebes, und die anschließende Zellsuspension wurde in Alginatkügelchen verkapselt.
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Methodenartikel
Dreidimensionale Alginat-Perle Kultur der Menschen Hypophysenadenom Cells
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Eine dreidimensionale Kulturverfahren ist in dem primären Hypophysenadenom Zellen sind in Alginatperlen gewachsen. Alginat ist ein Polymer aus Braun Meeresalgen abgeleitet. Kurz gesagt wird das Tumorgewebe in kleine Stücke geschnitten und einer enzymatischen Verdauung mit Collagenase und Trypsin vorgelegt. Als nächstes wird eine Zellsuspension erhalten. Die Tumorzellsuspension wird mit 1,2% Natriumalginat gemischt und in eine CaCl 2 -Lösung und die Alginat / Zellsuspension wird bei Kontakt mit der CaCl 2 gelierten kugelförmigen Kügelchen zu bilden. Die Zellen in den Alginatkugeln eingebettet sind mit Nährstoffen durch die Kulturmedium, angereichert mit 20% FBS vorgesehen geliefert. Dreidimensionalen Kultur in Alginat-Perlen hält die Lebensfähigkeit der Zellen Adenom für längere Zeit, bis zu vier Monate. Darüber hinaus können die Zellen aus dem Alginat befreit werden, indem die Kügelchen mit Natriumcitrat gewaschen und für weitere immunzytochemischen Analysen auf Deckgläser ausgesät. Die Verwendung eines cell Kulturmodell ermöglicht die Fixierung und Visualisierung der Aktin-Zytoskelett mit minimalem Desorganisation. Zusammenfassend bieten Alginatkügelchen eine zuverlässige Kultursystem für die Wartung von Hypophysenadenom Zellen.
Einleitung
Dreidimensionale Gerüste wurden in Zellkultur ausgiebig verwendet, weil sie eine dreidimensionale strukturelle Unterstützung für kultivierte Zellen und die Aufrechterhaltung der Zell-zu-Zell-Kommunikation 1 bereitzustellen. Natürlich abgeleitete Polymer-Materialien wurden zu machen dreidimensionalen Gerüsten einschließlich Typ I-Kollagen, Chitosan und Alginat. Alginat ist ein natürliches Polymer, abgeleitet von dem braunen Meeresalgen Macrocystispyrifera (Kelp). Dieses Polymer besteht aus wiederkehrenden Einheiten von β-D-Mannuronsäure (M) und α-L-Guluronsäure (G) 2 und bildet stabile Gele in Gegenwart von bestimmten zweiwertigen Kation....
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Protokoll
Diese Studie wurde für die Verwendung von menschlichem Material von den lokalen Ethikkommissionen der medizinischen Einrichtung und dem Zentrum für Forschung und Voraus Studien des Nationalen Polytechnischen Institut genehmigt.
1. Tumorprobe Acquisition
- Beziehen Sie die Hypophysenadenom Gewebebiopsie aus einem Patienten durch eine trans-Keilbein chirurgischen Eingriff 14.
- Sammeln Sie die Hypophysenadenom Probe und legen Sie sie in eine sterile Glasflasche mit 50 ml frischem 199 Kulturmedium (M199), angereichert mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 0,6 mg / ml Natriumbicarbonat, 2,4 mg / ml HEPES und 1% Antibi....
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Ergebnisse
Dieses Protokoll wurde für unterschiedliche Zeiträume erfolgreich in der Kultur und Wartung von Adenom der Hypophyse Zellen in Alginat-Perlen aufgebracht Abbildung 1 zeigt eingebetteten Zellen in Alginat-Perlen nach drei Monaten. Diese Zellen bi-Brechungs abgerundeten Formen unter einem umgekehrten Lichtmikroskop (Abbildung 1) zeigen, Fig. 2 die Lokalisierung von N-Cadherin in rat Hypophysenadenom Zellen in Alginat eingebettet zeigt. Die.......
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Diskussion
Dieses Protokoll hat mehrere wichtige Schritte. Die erste ist Perlgröße Homogenität, die erforderlich ist, die gleichen Bedingungen der Diffusion der Nährstoffe und Gase in der gesamten Zellkultur aufrecht zu erhalten. Nach unserer Erfahrung ist die Verwendung einer 21 G Nadel der Alginatkügelchen ermöglicht die Übernahme eines effizienten Kultur einheitliche Perlengrße zu machen. Der zweite wichtige Faktor ist der Abstand von der Nadel; Dieser Abstand darf nicht mehr als 5 cm von der Calciumlösung verformt Perlen und t.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Wir danken Herrn O. Rios für seine technische Unterstützung.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenz | |||
| 199 Kulturmedium | Invitrogen | 31100-027 | Für Kultur, warm in einem 37 Grad; C Wasserbad vor dem Gebrauch |
| Fötales Rinderserum | PAA | A15-751 | |
| Natriumbicarbonat (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N&akut;-2Ethansulfonsäure (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| PBS (Dulbecco-Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung) | Invitrogen | 21600-044 | |
| Kollagenase Typ I | Worthington | 4176 | |
| Trypsin | Invitrogen | 27250-018 | |
| Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| Sorbeanischer Trypsin-Inhibitor | Invitrogen | 17075-029 | |
| DNAse | Worthington | 2139 | |
| Alginsäure, aus Macrocystis pyrifera (Seetang) | Sigma | A-2158 | |
| Calciumchlorid (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| Natriumcitrat (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| Piperazin-N,N′-bis(2-ethansulfonsäure) (PIPES) | Forschung Organische Stoffe | 9624P | |
| Polyethylenglykol 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| Ethylen Glykoltetraessigsäure (EGTA) | Forschung Organische Stoffe | 9574E | |
| Magnesiumsulfat (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| Triton-X 100 | Sigma | X100 | |
| Formaldehyd | J.T. Baker | 2106 | |
| Paraformaldehyd | Sigma | P6148 | |
| Ammoniumchlorid (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| BSA Rinderserumalbumin IgG-frei | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| Phalloidin– Tetramethylrhodamin B-Isothiocyanat | Sigma | P1951 | Giftig. Verwenden Sie Handschuhe, um dieses Reagenz zu handhaben |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole, Dihydrochlorid (DAPI) | Invitrogen | D1306 | Giftig. Verwenden Sie Handschuhe, um dieses Reagenz zu handhaben |
| Schwefelsäure (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | Hochkorrosiv. Verwenden Sie Handschuhe, um dieses Reagenz zu handhaben |
| Natriumhydroxid (NAOH) | Merck | 1.06498 | Kann Augen- und Hautreizungen verursachen. Verwenden Sie Handschuhe, um dieses Reagenz zu handhaben |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilan (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| Poly-D-Lysinhydrobromid | Sigma | P7280 | |
| Trypanblau-Lösung | Sigma | T8154 | |
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
| Ausstattung | Giftig: Kann Krebs verursachen. Verwenden Sie Handschuhe, um dieses Reagenz zu handhaben | ||
| Rotator | Boekel Scientific | Modell 230300 | |
| Zentrifuge | DuPont Corporation | Modell sorvall TC6 | |
| Shaker | Laborgeräte | Modell 314-820 |
Referenzen
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as Extracellular Matrix Mimics for 3D Cell Culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol. Bioeng. 65 (5), 605-610 (1999).
- ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
