Die aktuellen Protokolle zur Erhaltung immortalisierter multipotenter otischer Vorläuferzellen (iMOP) und der otischen Differenzierung werden beschrieben. Kulturbedingungen und molekulare Marker, die auf eine Differenzierung in sensorische Epithelien und Spiralganglienneuronen (SGN) hinweisen, werden hervorgehoben.
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Methodenartikel
Initiieren Differenzierung in Immortalisierte multipotenten Vorläuferzellen Otic
* These authors contributed equally
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Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Verwendung von humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) oder embryonalen Stammzellen (ESC) für Zellersatztherapien ist vielversprechend. Mehrere Einschränkungen, darunter geringe Erträge und heterogene Populationen differenzierter Zellen, behindern den Fortschritt von Stammzelltherapien. Es wurde eine verbleibsbeschränkte immortalisierte multipotente otische Vorläuferzelllinie (iMOP) generiert, um die effiziente Differenzierung einer großen Anzahl von funktionellen Haarzellen und Spiralganglienneuronen (SGN) für Innenohr-Zellersatztherapien zu ermöglichen. Ausgehend von dissoziierten Kulturen einzelner iMOP-Zellen wurden Protokolle beschrieben, die den Austritt aus dem Zellzyklus und die Differenzierung durch den Entzug des basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktors (bFGF) fördern. Ein signifikanter Rückgang der proliferierenden Zellen nach bFGF-Entzug wurde mit einem EdU-Zellproliferationsassay bestätigt. Parallel zu einer Abnahme der Proliferation führte die erfolgreiche Differenzierung zur Expression molekularer Marker und morphologischer Veränderungen. Die Immunfärbung von Cdkn1b (p27KIP) und Cdh1 (E-Cadherin) in iMOP-abgeleiteten Otosphären wurde als Indikator für die Differenzierung in sensorische Epithelien des Innenohrs verwendet, während die Immunfärbung von Cdkn1b und Tubb3 (neuronales β-Tubulin) zur Identifizierung von iMOP-abgeleiteten Neuronen verwendet wurde. Die Verwendung von iMOP-Zellen ist ein wichtiges Werkzeug zum Verständnis von Entscheidungen über das Zellschicksal, die von neurosensorischen Vorläuferzellen des Innenohrs getroffen werden, und wird dazu beitragen, Protokolle für die Erzeugung einer großen Anzahl von iPSC- oder ESC-abgeleiteten Haarzellen und SGNs zu entwickeln. Diese Methoden werden die Bemühungen um die Generierung von otischen Zellen für Ersatztherapien beschleunigen.
Einleitung
Die Organe des Innenohrs, der Cochlea, des Utrikels, des Saccule und der drei Bogengänge vermitteln die Fähigkeit zu hören und zu balancieren. In der Cochlea wandeln Haarzellen Geräusche in elektrische Signale um, die an die Neuronen der Spiralganglien (SGN) weitergeleitet werden. Die SGNs feuern Aktionspotentiale ab, um neuronale Signale durch den auditorischen Schaltkreis zu verbreiten. Genetische Mutationen, ototoxische Medikamente und die Exposition gegenüber lauten Geräuschen tragen zum Absterben von Haarzellen und SGN bei, die zu Hörverlustführen 1-4. Einmal verloren, werden diese Zellen nicht mehr ersetzt. Die Verwendung von iPSC und ESC zur Erzeug....
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Protokoll
1. Die Aufrechterhaltung der Selbsterneuerung in IMOP Cells
- Bereiten iMOP Kulturmedien: DMEM / F12, 1X B27 ergänzen, 25 ug / ml Carbenecillin und 20 ng / ml bFGF. Machen Sie 50 ml iMOP Kulturmedien unter Verwendung von sterilen Reagenzien. Warm up 49 ml DMEM / F12 in einem 50 ml konischen in einem 37 ° C Wasserbad.
- Auftau 50X B27 Supplement und filtersterilisiert 100 mg / ml Carbenecillin Aliquots für 5 min in einem 37 ° C Wasserbad. Auftauen 100 ug / ml bFGF Aliquot bei RT. 1 ml 50X B27, 10 ul 100 ug / ml bFGF und 12,5 & mgr; l von 100 mg / ml Carbenecillin in DMEM / F12.
- Verwenden Sie 3 ml Medium in einem 60 mm-Gewebekultursc....
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Ergebnisse
bFGF Widerrufs Verringert Proliferation in IMOP Cells
Um die proliferative Kapazität von iMOP Zellen zu verringern und zu initiieren Differenzierung iMOP Zellen wurde bFGF aus den Kulturen entnommen. Um zu bestätigen, dass die Wachstumsfaktorentzug verringert Proliferation wurde EdU Einarbeitung als Proliferationstest verwendet. Der Prozentsatz von Zellen, die aus EdU otospheres mit iMOP Kulturmedium (enthalte.......
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Diskussion
Überwachung IMOP Kulturen
Ein Protokoll zum Aufrechterhalten der Selbsterneuerung und die Förderung der Differenzierung einer neuartigen iMOP Zellinie beschrieben und zusätzliche Plattierung Formate enthalten sind (Tabelle 1). Mehrere wichtige Schritte, die mit Routine Expansion und Differenzierung von Zellen iMOP helfen, werden zur Kenntnis genommen. Ähnlich wie pluripotente Stammzellkulturen, iMOP Zellen haben theoretisch eine unbegrenzte Lebensdauer. Um s.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts offenzulegen.
Danksagungen
Die Arbeit wurde teilweise durch den Duncan and Nancy MacMillan Faculty Development Chair Endowment Fund (K.Y.K.), Busch Biomedical Research Grant (K.Y.K.) und den Rutgers Faculty Development Grant (K.Y.K.) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| CoolCell LX Alkoholfreie Zellgefrierbehälter | BioCision | BCS-405 | |
| Kryofläschchen (2 ml) | Corning | 430654 | |
| 1,5 Dicke Glasdeckglas (rund 12 mm) | Elektronenmikroskopie Wissenschaften | 72230-01 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320-082 | |
| Neurobasales Medium | Life Technologies | 21103 | |
| Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 | Life Technologies | 10010-023 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14025-092 | |
| B27 Supplement (50X) Serum Free | Life Technologies | 17504-044 | Gelagert als 1 ml Aliquot |
| L-Glutamin (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | Gelagert als 5 ml Aliquots |
| Natural Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Gelagert als 1 mg/ml Aliquots |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 488 | Life Technologies | C10337 | |
| Synth-A-Freeze Kryokonservierungsmedium | Life Technologies | A12542-01 | |
| Prolong Gold Antifade Eindeckmittel | Life Technologies | 47743-736 | Gelagert als 10 mg/ml 100 & Mikro; l aliquots |
| Moxi Z Mini Automatisierter Zellzähler | Orflo | MXZ001 | |
| Moxi Z Kassette Typ S | Orflo | MXC002 | |
| Rekombinanter Maus-Fibroblasten-Wachstumsfaktor, basisch (bFGF) | Peprotech | 450-33 | Resuspendiert in 0,1 % BSA in H20 und gelagert als 20 mg/ml Aliquots |
| Poly-D-Lysin | Sigma | P7886 | Resuspendiert in 1X PBS und gelagert als 10 mg/ml 100 & Mikro; l aliquot |
| Carbenicillin, Dinatriumsalz | Thermo Fisher Scientific | BP2648-1 | Resuspendiert in 10 mM Hepes pH 7,4 und gelagert als 100 mg/ml Aliquote |
| 5 ml Pipette einzeln verpackt Taschenbuch (200/Karton) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 ml Pipette einzeln verpackt Taschenbuch (200/Karton) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Mit Gewebekulturen behandelte Biolite 24-Well-Platte | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Mit Gewebekulturen behandelte Biolite 6-Well-Platte | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| Mit Gewebekulturen behandelte 6 cm Schale | Thermo Fisher Scientific | 130181 | |
| EMD Millipore Millex Sterilspritze PVDF Filter Porengröße: 0,22 μ m | Thermo Fisher Scientific | SLGV033RS | |
| TipOne Filterpipettenspitzen 0,1 - 10 μ l längliche Filterspitze | USA Scientific | 1120-3810 | |
| TipOne Filterpipettenspitzen 1 - 20 μ l Filterspitze | USA Scientific | 1120-1810 | |
| TipOne Filterpipettenspitzen 1 - 200 μ l Filterspitze | USA Scientific | 1120-8810 | |
| TipOne Filterpipettenspitzen 101 - 1000 μ l Filterspitze | USA Scientific | 1126-7810 | |
| 15 ml konische Röhrchen steril 20 Beutel à 25 Röhrchen (500 Röhrchen) | USA Scientific | 1475-0511 | |
| 50 ml konische Röhrchen steril 20 Beutel à 25 Röhrchen (500 Röhrchen) | USA Scientific | 1500-1211 |
Referenzen
- Petit, C., Richardson, G. P. Linking genes underlying deafness to hair-bundle development and function. Nat Neurosci. 12 (6), 703-710 (2009).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after 'temporary'....
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Nachdrucke und Genehmigungen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
A correction was made to the Authors section in: Initiating Differentiation in Immortalized Multipotent Otic Progenitor Cells.
One of the authors' names was corrected from:
Jadali Azadeh
to:
Azadeh Jadali
