Colheita seletiva de Marginating-pulmonar Leucócitos
Summary
Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.
Abstract
Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.
Introduction
Os leucócitos aderentes para os capilares dos pulmões (isto é, marginating-pulmonar (MP) leucócitos) foram 1 mostrado exibir composição distinta de leucócitos e a actividade única em comparação com os leucócitos a partir de outros compartimentos do sistema imunológico (por exemplo, circulação, do baço, da medula óssea) 2- 4. Por exemplo, exposição de MP-leucócitos maior células assassinas naturais (NK) a citotoxicidade contra diversas células tumorais, em comparação com células circulantes e esplénicos NK, bem como os níveis de RNA mensageiro (mRNA) diferenciadas e aumento da secreção de citoquinas pró-inflamatórias e anti. A composição das células também é diferenciado a partir de leucócitos circulantes como MP-leucócitos têm uma proporção mais elevada de imunidade inata / adaptativa em comparação com os leucócitos circulantes (50% vs. 30%, respectivamente). O objectivo do método aqui apresentado é o de permitir a colheita selectiva de MP-leucócitos, a fim de estudar este compartimento imunológica importante e original (população de células), e a elucIdate o impacto das diversas manipulações (por exemplo, ativação imune) sobre essas células específicas.
Para compreender o significado deste população original, é importante notar que o sistema imune pode controlar células tumorais, micrometástases e de doença residual que circula através de funções in vivo de imunidade mediada por células (CMI). Esta capacidade é evidente, apesar da falha precedente do sistema imunitário para controlar o tumor primário, e suportado por um amplo evidências in vivo em doentes com cancro e em modelos animais 5. Mais importante, estes resultados são muitas vezes inconsistentes com estudos in vitro e ex vivo, que reportam que a maioria das células tumorais autólogas são resistentes a citotoxicidade por leucócitos em amostras de sangue em circulação a partir de seres humanos e animais (medido por ensaios de citotoxicidade) 6,7. Esta discrepância pode ser atribuída à existência in vivo, de populações de leucócitos distintas, tais como o supramencionado população de leucócitos MP e, especificamente, a sua subpopulação de células NK activadas 3. Com efeito, as células singeneicas de tumor (MADB106), que se verificou ser resistente à circulante e leucócitos esplénicas, foram mostrados para serem lisadas por células NK-MP 3,8. Assim, as células '' resistentes a NK-alegadamente MADB106 que metastizam para os pulmões de ratos fischer344 (F344) são controlados por células NK-MP, mas não por células NK circulantes ou esplénicas, que são vulgarmente estudada, dada a sua facilidade de acesso.
Purificada e activas MP-leucócitos são inacessíveis através dos métodos de colheita padrão de leucócitos a partir dos pulmões, os quais são baseados na moedura de tecido pulmonar ou degradação biológica 9. A nossa abordagem tem duas vantagens principais em comparação com abordagens de processamento de tecidos. Em primeiro lugar, a abordagem de perfusão colhe seletivamente MP-leucócitos, separando-os de outras células que se originam a partir do parênquima pulmonar, intersticial e compar bronco-alveolartimentos. Em segundo lugar, a técnica de perfusão melhor preserva a integridade e o meio fisiológico de MP-leucócitos, ao contrário da moagem e processamento biológico abordagens que danificam as células, alteram a sua morfologia, e induzem a produção e libertação de vários factores que modulam a actividade imunológica e especificamente suprimem NK citotoxicidade 10.
Os pulmões são um dos principais alvos de metástase do câncer e para várias doenças infecciosas. Todas as células malignas circulantes e células infectadas passar através dos capilares pulmonares, onde eles precisam deformar e interagir com as células endoteliais capilares e leucócitos residentes. Sob estas condições, as células circulantes podem ser facilmente alvo de MP-leucócitos residentes. Parece, portanto, biologicamente vantajoso ter leucócitos activados neste compartimento imune, e é importante para estudar esta MP-população única em diferentes configurações biológicos, experimentais, e clínicos. É digno de nota que syactivação stemic imune por vários-resposta-modificadores biológicos (por exemplo, ácido polyinosinic-polycytidylic (poli I: C) ou oligodesoxinucleótidos tipo-C CpG (CpG-C ODN)) ter mostrado activar MP-leucócitos mais de leucócitos circulantes 3, 8,11.
Protocol
Representative Results
Discussion
O método aqui apresentado permite a colheita selectiva e estudo da população única de MP-leucócitos. Em comparação com circulante ou leucócitos esplénicas, a população MP é caracterizada por uma composição distinta de subpopulações de leucócitos, níveis de activação mais elevadas, maior libertação de várias citocinas, e mais elevados os níveis de mRNA de citocinas pró- e anti-inflamatórios 2,3. Especificamente, mostraram que as células NK-MP são mais citotóxicos do que as células…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores e este trabalho foram apoiados pelo NIH / NCI conceder # R01CA172138 (a SBE).
Materials
| Autoclud Peristaltic pump | |||
| Butterfly needle | OMG | 26G | |
| Butterfly needle | OMG | 21G*3/4" | |
| Syringe | Pic solution | 1 ml | |
| Syringe | Pic solution | 2.5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 5 ml | |
| Syringe | Pic solution | 10 ml | |
| Syringe | Pic solution | 25 ml | |
| Blunted-edged forceps | |||
| Scissors | |||
| hemostat | |||
| Tissue forceps | |||
| Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) | Sigma Aldrich |
Referenzen
- Kuebler, W. M., Goetz, A. E. The marginated pool. Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).
- Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
- Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
- Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
- Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
- Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
- Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
- Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
- O’Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
- Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. , (2014).
- Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).
