Tilstedeværelsen af cancer stamceller (CSCS) i knoglesarkomer er for nylig blevet forbundet med deres patogenese. I denne artikel præsenterer vi isolering af CSCS fra primære cellekulturer opnået fra menneskelige biopsier af konventionel osteosarkom (OS) ved hjælp evne CSCS til at vokse under ikke-vedhæftende betingelser.
De nuværende forbedringer i terapi mod osteosarkom (OS) har forlænget livet for kræftpatienter, men overlevelsesraten på fem år er fortsat dårlig, når metastaser er opstået. Cancer Stem Cell (CSC) teori hævder, at der er en delmængde af tumorceller i tumoren, der har stamceller-lignende egenskaber, herunder evnen til at opretholde tumoren og til at modstå multilægemiddelresistens kemoterapi. Derfor er der behov for en bedre forståelse af OS biologi og patogenese for at fremme udviklingen af målrettede behandlinger for at udrydde denne delmængde og reducere sygelighed og dødelighed blandt patienter. Isolering CSCS, oprettelse cellekulturer af CSCS, og studere deres biologi er vigtige skridt til at forbedre vores forståelse af OS biologi og patogenese. Etableringen af humanafledt OS-CSCS fra biopsier af OS er blevet gjort muligt ved hjælp af flere metoder, herunder evnen til at skabe 3-dimensionelle stamcellekulturer under nonadherent forhold. Under disse betingelser CSCS kan skabe sfæriske flydende dannede kolonier af datterceller stamceller; disse kolonier betegnes "cellulære kugler". Her beskriver vi en fremgangsmåde til at etablere CSC kulturer fra primære cellekulturer af konventionel OS opnået fra OS biopsier. Vi beskriver klart de mange passager, der er nødvendige for at isolere og karakterisere CSCS.
Sarkomer er en heterogen gruppe af sjældne maligne bindevævsceller tumorer med oprindelse overvejende fra det embryoniske mesoderm 1. De forskellige typer omfatter knoglesarkomer og bløddelssarkomer. Knoglesarkomer, en gruppe af relativt ualmindelige primære tumorer, består af flere undertyper, herunder osteosarcom (OS). OS, en af de mest almindelige primære tumorer i knogler, er en mesenchymal malignitet som udviser omfattende klinisk, histologiske og molekylære heterogeniteter 2, 3. Desværre OS forekommer overvejende hos børn og unge voksne 4, 5 og repræsenterer 60% af de fælles histologiske undertyper af knogle sarkom i barndommen 6, 7. OS normalt påvirker skeletområder, der er kendetegnet ved hurtig vækst knogle (f.eks den metafyse af lange knogler). Blandt de histologisk forskellige undertyper af OS, konventionel OS, også kaldet medullær eller central OS, har en høj grad af malignitet og en kvote share på 80% 8. Dette 80% er sammensat af 60% konventionel osteoblastisk OS, 10% chondroblastic OS, og 10% fibroblastisk OS 6, 8-10. Andre OS undertyper omfatter anaplastisk, telangiectatic, kæmpe celle-rige og småcellet OS. Trods fremskridt i kombineret kirurgi og kemoterapi i OS ledelse, resultatet forbliver fattige, med en langsigtet overlevelse på 65-70% hos patienter uden metastaser 11, 12. Distant gentagelser ofte forekomme som pulmonale metastaser eller, mindre hyppigt, som metastaser til fjerne knogler og lokale gentagelser 13. Metastaser er ofte resistente over for konventionelle behandlinger. Denne modstand er grunden til, at 10-års sygdomsfri overlevelse er ca. 30% hos patienter med metastatisk sygdom på diagnosetidspunktet 14, 15.
Som med normalt væv, er cancervæv sammensat af en heterogen samling af celletyper. Celler i tumoren synes at svare til forskellige udviklingsstadier. Inden enhver normal væv bor en subpopulation af celler med evnen til at selfrenew, hvilket giver progenitorer og modne celler til vævshomeostase. Tilsvarende er cancer sammensat af en lignende heterogen population af celler på forskellige udviklingsstadier, med forskellige grader af proliferation og tumorigene potentiale. En undergruppe af disse cancerceller, betegnet cancerstamceller (CSCS), udgør et reservoir af selfsustaining celler med den eksklusive evne til selfrenew og opretholde maligne potentiale af tumorer, hvorved der genereres af de forskellige cellelinier, der udgør tumormasse 16. I 1990'erne, undersøgelser af akut myeloid leukæmi forudsat den første overbevisende beviser for eksistensen af CSC subpopulationer 17, 18. CSCS er siden blevet isoleret fra et stort antal solide tumorer 19 og blev dermed en af de mest undersøgte emner i kræftforskning. CSCS kan faktisk skyldes normale stamceller ved mutationer i gener, der gør det normalestamceller cancrøse 20-23. Flere omdanne mutationer og interaktioner med mikromiljø kunne også bidrage til sunde stamfædre og modne celler erhverver den selfrenewal kapacitet og udødelighed som typiske CSCS. Der er flere hypoteser om denne transformation. Sunde progenitorer, sunde modne celler, og cancerceller, kan dedifferentiere til stamceller, opnåelse af et stem-lignende fænotype ved at aktivere selfrenewal-associerede gener 24-28. Trods flere nylige undersøgelser, oprindelsen af CSCS endnu at blive opdaget.
Et særligt kendetegn ved CSCS er, at deres evne til at modstå den multi-terapi tilgang, som består af kombineret kirurgi og kemoterapi med forskellige lægemidler. Nylige undersøgelser har vist, at CSCS også kan erhverve resistens over for cytotoksisk kemoterapi agenter. Mulige forklaringer på denne modstand omfatter overekspression af ATP-bindende kassette (ABC) multilægemiddeltransportøren (dvs.MDR1 og BCRP1), overekspression af kemoterapi enzymer såsom aldehyd dehydrogenase 1 (ALDH1), og / eller ændringer i cellecykluskinetikken 30-33. Den direkte konsekvens af alle disse begreber, der er beskrevet indtil nu er, at en cancerterapi ville være effektiv, hvis CSC subpopulation blev fuldstændigt elimineret, mens lokalt recidiv eller fjernmetastaser kunne opstå, hvis blot en enkelt CSC overlevede.
Opdagelsen af CSCS i menneskelig sarkomer 34, især OS 35, eller i nogen anden knogle og blødt væv kræft, har stor klinisk betydning, fordi det giver en mulig forklaring på, hvorfor mange behandlinger synes at være effektive i første omgang, men patienterne senere tilbagefald. Derfor er håb for fremtiden kamp mod konventionel OS er at finde nye og specifikke målrettede behandlinger baseret på udvikling af innovative lægemidler rettet mod OS-CSCS takket være den molekylære karakterisering af denne subbefolkning og til studiet af CSC biologi.
I 1992 Reynolds og kolleger, som var at undersøge, om en undergruppe af stamceller var til stede i et voksent pattedyr hjerne, udviklet en metode til isolering af celler, der formodes at være stamme-lignende celler 36, 37. Denne metode er baseret på den særlige evne disse celler til dannelse af sfæriske kolonier ved dyrkning under ikke-adhærerende betingelser. Lignende teknikker blev ansat af Gibbs og kolleger i 2005 for at studere en subpopulation af stamceller-lignende celler i knogler sarkomer 38. For at isolere og karakterisere OS-CSCS fra primære cellekulturer af forskellige typer af konventionelle OS, besluttede vi at tilpasse denne teknik til OS cellelinjer.
Her beskriver vi denne tilpassede fremgangsmåde af kuglen dannelse assay betegnet "sarcosphere assay", som kan anvendes til isolering OS-CSCS af finite primære cellelinjer afledt af humane biopsier af konventionel OS. Vi beskriver også alle de teknikker used at validere stamme-lignende CSC fænotype af cellelinierne isoleret ved denne analyse: 1) vurdering af ekspressionen af gener, der kendetegner pluripotente embryonale stamceller (EKSF) og CD133-genet, som er en markør for CSCS; 2) kolonidannende enhed (CFU) assay; 3) evaluering af evnen af disse celler til at differentiere til osteoblaster og adipocyter under passende differentieringstilstande; 4) Undersøgelse af overflademarkører af mesenchymale stamceller (MSC'er) (dvs. CD44, CD105 og Stro-1) efter immunfluorescensfarvning og ved hjælp af flow cytometrisk analyse; 5) evaluering af ALDH aktivitet af disse celler.
CSCS har flere egenskaber, der gør det muligt at identificere denne særlige cellulære delmængde i tumoren bulk. På grundlag af disse karakteristika, såsom erhvervet resistens over for cytotoksisk kemoterapi midler til overekspression af ATP-bindende kassette multidrug effluxtransportører 28, 32, 33, eller for opregulering af ekspressionen af afgiftning enzymer, såsom ALDH 32, til ekspression af en bestemt overflademarkør, såsom CD133, CD44, CD34, CD90, og andre 30, 34, 35, 41, flere forskellige metoder til isolering CSCS er blevet udviklet 42-44. En af disse teknikker er sfæren formation assay som er baseret på evne CSCS til at vokse under ikke-adhærente betingelser.
Evnen af væv stamceller og CSCS at danne sfærer blev først beskrevet i undersøgelser til kortlægning af neurale stamceller ved Reynolds et al. 37. Efterfølgende Gibbs et al. 38 osed disse undersøgelser for at begynde at isolere CSCS fra solide tumorer, især fra knogle sarkomer. Vi har besluttet at bruge kuglen dannelse assay metode illustreret af Gibbs et al. At isolere CSCS fra OSA cellelinjer skabt på grundlag konventionelle OS biopsier. Vi tilpasset den oprindelige metode til at forbedre resultaterne af dette assay og for at lette dens reproducerbarhed for andre cancercellelinjer. Med henvisning til oprettelsen af kuglen dannelse assay, vi kontrolleret, at plating 40.000 celler / brønd er en god praksis for at opretholde celler i isolation i begyndelsen af analysen. Dette trick er meget vigtigt at undgå muligheden for, at de sfæriske kolonier stammer fra cellulær aggregering og ikke fra den særlige og eksklusive kapacitet af en enkelt CSC til at vokse under ikke-adhærente betingelser og danne en sfærisk koloni. Denne evne er en særlig kritisk punkt i dette assay.
Vi certificeret også, at for at opnå en god sats af kugle-dannelseEr det tilstrækkeligt at opdatere portioner af vækstfaktorer hver 3 d og ikke hver dag som beskrevet i den oprindelige fremgangsmåde. I denne undersøgelse har vi også etableret og beskrevet udførligt en god metode til isolering af de sfæriske kolonier, der dannede ved dyrkning under ikke-adhærente betingelser. Dette trin er kritisk i dette assay, fordi det er meget vigtigt at forsøge at isolere så mange af kuglerne som muligt, der er dannet i hver brønd uden at beskadige dem. Det er også vigtigt at isolere kun kugler og ikke de enkelte celler, som kunne forblive i suspension for varigheden af assayet. For at overvinde disse kritiske punkter, har vi udviklet et særligt isolation metode, der, som vist ovenfor, gav gode resultater for CSC isolation. Der er naturligvis mulighed for, at ikke alle de kugler, der dannede kan udvindes, men tabet i procent er meget lav. Faktisk har vi også mulighed for at bruge et filter med 40 um porer at isolere kugler efter de bliver store (formulared ca. 100 – 200 blodlegemer).
Denne isolation stopper sfære formation men tillader de enkelte celler, en del af methylcellulose resten, og de mindste kugler, der skal filtreres. Denne eliminering er udført af grundig filtrering som beskrevet i protokollen.
Endvidere udvælgelsen af de største sfæriske kolonier gennem de 40 um mesh med deraf følgende tab af de mindste sfæriske kolonier gør det muligt at vælge de CSCS med den højeste kapacitet til at danne sfæriske kolonier og med større stemness. Alle disse ændringer blev udført for at forbedre analysen og at hjælpe forskere studerer CSCS at forstå og gengive det mest kritiske trin i den oprindelige metode af kuglen dannelse analysen.
Blandt de undersøgelser vedrørende in vitro-metoder til isolering CSCS, denne undersøgelse havde til formål at vise, hvordan denne tilpasset sfære dannelse assay kunne være en god fremgangsmåde til isolering CSCS fraOSA cellelinier. Tilpasningerne til den oprindelige metode og den detaljerede isolation teknikken beskrevet forbedre dens effektivitet. I en kort tid, kan der opnås og anvendes til flere eksperimenter god antallet af CSCS. Derfor er det muligt hurtigt bekræfte stamceller-lignende fænotyper og navnlig, at studere den dobbelte stilk-lignende fænotype der kendetegner OS-CSCS. Således kunne denne modificerede assay være en god teknik til isolering af CSCS og studere deres biologi. I fremtiden, denne metode, med yderligere tilpasninger, kan også anvendes til at isolere CSCS fra andre finite cancercellelinier opnået ved biopsier af sjældne faste tumorer.
Muligheden for at isolere CSCS fra sjældne solide tumorer, såsom OS, ikke kun tillader en forbedring af undersøgelser om denne særlige kræft, men også omfatter undersøgelser af forskellige former for kræft at udvikle bedre metoder til deres isolation og til fremtidige undersøgelser af biologi denne vigtige cellulære delmængde. Derfor, som vihar gjort i denne undersøgelse, er det vigtigt at forbedre metoderne til CSC isolation gennem studiet af CSC biologi, med det endelige mål at finde molekylære mål og udvikle en meget specifik anticancer terapi rettet mod netop denne cellulære delmængde, der er sandsynligvis ansvarlig for opretholdelse af den primære tumor, udvikling af gentagelse, og oprindelsen af metastaser i flere organer. Studiet af CSC biologi er også vigtigt for at finde behandlinger, som kunne være skarp i helbredelse af kræftformer, såsom OS, for hvilke overlevelsesraten efter neoadjuverende behandling forbliver meget dårlig.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by ITT (Istituto Toscano Tumori) Grant Proposal 2010.
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Ca and Mg (DPBS) | LONZA | BE17-513F | _ |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline without Ca and Mg (DPBS) | LONZA | BE17-512F | _ |
Porcine Trypsin 1:250 | BD Difco | 215310 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate(EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Powder |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C0130 | Solvent: Buffer Solution pH 7.4. Stock concentration: Powder |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | BDH Chemicals-VWR | 10323 | _ |
Nutrient Mixture F-12 Ham | Sigma-Aldrich | F6636 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
2-Phospho-L-ascorbic acid trisodium salt | Sigma-Aldrich | 49752 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 5 mg/ml |
β-Glycerol phosphate disodium salt pentahydrate | Sigma-Aldrich | 50020 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 1M |
Insulin. Human Recombinant | Sigma-Aldrich | 91077 | Solvent: NaOH 0.1M. Stock concentration: 10 mM |
3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 500 mM |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 200 mM |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | Solvent: DMSO. Stock concentration: 1 mM / 100 µM. Stock in nitrogen liquid to maintain the biological activity |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | _ |
Fetal Bovine Serum South America | EUROCLONE | ECS0180L | _ |
Penicillin-Streptomycin (PEN-STREP) 10,000 U/ml | LONZA | DE17-602E | _ |
Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | 274429 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: 2% |
Putresceine dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P5780 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
apo-Transferrin | Sigma-Aldrich | T-1147 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 25 mg/ml |
Human Epidermal Growth Factor (EFGF) | Sigma-Aldrich | E5036 | Solvent: DPBS pH 7.4. Stock concentration: 10 µg/ml |
Fibroblast Growth Factor-Basic Human | Sigma-Aldrich | F0291 | Solvent: DPBS +0.2% BSA. Stock concentration: 25 µg/ml |
Selenous Acid | Sigma-Aldrich | 211176 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 30 mM |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Solvent: ETOH. Stock concentration: 10 mM |
Toluidine Blue O | Sigma-Aldrich | 198161 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
Oil Red O | ICN Biochemicals | 155984 | Solvent: 2-Propanol. Stock concentration: Powder |
Naphtol AS-MX Phosphate Disodium Salt | Sigma-Aldrich | N5000 | Solvent: DMSO. Stock concentration: Powder |
Fast Blue BB Salt | Sigma-Aldrich | F3378 | Solvent: TrisHCL pH 9.0. Stock concentration: Powder |
Fast Red Violet LB Salt | Sigma-Aldrich | F3381 | Solvent: TrisHCL pH 9.1. Stock concentration: Powder |
Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA) | Sigma-Aldrich | A-4503 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 2% |
Alizarin Red S | ICN Biochemicals | 100375 | Solvent: Ultrapure dH2O. Stock concentration: Powder |
Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | 533998 | 4% |
Triton 100X | MERCK | 11869 | Solvent: DPBS. Stock concentration: 0.2%. Danger_Use only under chemical wood |
Calcein | MERCK | 2315 | Solvent: DPBS . Stock concentration: 200 µg/ml |
2-Propanol | MERCK | 109634 | Danger_Use only under chemical wood |
Ab-CD105 (Mouse monoclonal [SN6] to CD105 (FITC) | Abcam | ab11415 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD44 (Mouse monoclonal [F10-44-2] to CD44 (PE/Cy7®) ) | Abcam | ab46793 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD45 (Mouse monoclonal [MEM-28] to CD45 (PerCP)) | Abcam | ab65952 | Liquid. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) |
Ab-CD105 (Human CD105 Purified Antibody) | Invitrogen | MHCD10500 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
Ab-CD44 (Anti-CD44 Antibody) | Abcam | EPR1013Y(ab51037) | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
Ab-Stro-1 (Mouse anti-STRO-1) | Invitrogen | 398401 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) Immunofluorescence staining (IF) |
Alexa Fluor 488 (Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)) | Invitrogen | A-21206 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
FITC Anti-Mouse IG (FITC-Rabbit Anti Mouse IgG (H+L)) | Invitrogen | 61-6511 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Flow Cytometry (Flow Cyt) Immunofluorescence staining (IF) |
Alexa Fluor 635 Phalloidin | Invitrogen | A34054 | Solvent: DPBS. Stock concentration: Lyophilized. Application: Immunofluorescence staining (IF) |
AutoMACS™Running Buffer MACS Separation Buffer | Miltenyi | 130,091,221 | Liquid. Store at 4°C |
QIAzol®Lysis Reagent | QIAGEN | 79306 | Danger_Use only under chemical wood |
QUANTITECT® Reverse Transcription Kit | QIAGEN | 205314 | _ |
Chlorophorm | Sigma-Aldrich | C2432 | Liquid. Danger_Use only under chemical wood |
Laminar flow hood | GELAIRE | BSB6A | _ |
Chemical hood | ARREDI TECNICI Villa | Modello DYNAMICA | _ |
CO₂ incubator | Officine Meccaniche KW | CO2W91 | _ |
Centrifuge | EPPENDORF | 5415R | _ |
Laser Scanning Confocal Microscopy LSM 5109 Meta | ZEISS | _ | _ |
iCycler PCR Thermalcycler | BIORAD | _ | _ |
CyFlow®SPACE | (PARTEC) | _ | _ |
Inverted Micrposcope Axiovert 200M | ZEISS | _ | _ |
Freezing container , | Nalgene | _ | _ |
Original Pipet-Aid | pbiBrand | _ | _ |
Micropipettes | EPPENDORF | _ | _ |
Glass Pasteur Pipette | SIGMA | _ | _ |
VICTOR3™ | PERKIN ELMER | _ | _ |
Conical tubes (15 and 50 mL) | BD FALCON | 352096 (for 15 mL) 352070 (for 50 mL) | _ |
24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate | BD FALCON | 353047 | _ |
6 Well Clear Flat Bottom Ultra Low Attachment Multiple Well Plates | CORNING | 3471 | _ |
Serological pipettes (5 and 10 mL) | BD FALCON | 357543 (for 5 mL) 357551 (for 10mL) | _ |
Syringe (5mL) | B|BRAUN | 4617053V | _ |
Petri dish 100X20 mm | BD FALCON | 353003 | _ |
Röhren Tubes (3,5 ml, 55x12mm, PS) | SARSTEDT | 55,484 | _ |
Petri dish 60X15 mm | BD FALCON | 353004 | _ |
Cryovials 1.5 ml | NALGENE | 5000-1020 | _ |
Cell CultureFlasks 25 cm² | BD FALCON | 353014 | _ |
Nylon Net Filter, Hydrophilic | MERCK | NY4104700 | _ |
Swinnex Filter Holder | MERCK | SX0002500 | _ |
Perry tweezer | _ | _ | _ |
Lancet | _ | _ | _ |
Dounce | _ | _ | _ |