Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).
למרות ההתקדמות בהבנת הראש קרצינומה תאים קשקשיים הצוואר (HNSCC) התקדמות, שיעור הישרדות של חמש שנים נותרה נמוכה בשל הישנות מקומית גרורות מרוחקות. השערה אחת להסביר הישנות זה היא הנוכחות של תאי גזע דמוי סרטן (CSCS) שמציגים chemo- מובנה וסיכון-התנגדות רדיו. על מנת לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, יש צורך יש דגמים ניסיוניים המאמתים את היעילות של טיפולים ממוקדים ולכן יש שיטות אמינות לזיהוי והבידוד של CSCS. לשם כך, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד של CSCS שורות תאי HNSCC אדם מסתמך על השילוב של שני sortings תא הרצוף מבוצע על ידי תא מופעל קרינת מיון (FACS). האחת מבוססת על הנכס של CSCS כדי overexpress ATP-כריכה קלטת (ABC) חלבונים טרנספורטר ובכך לכלול, בין היתר, צבעים DNA חיוניים כגון Hoechst 33342. התאים מסודרים עם השיטה מזוהית בתור "אוכלוסייה בצד" (SP). כאשר תאי SP מהווים אחוז נמוך (<5%) של תאים הוריים, שלב הולך וגדל הוא הכרחי על מנת להגדיל את מספרם לפני מיון התא השני. השלב הבא מאפשר את הבחירה של תאים שיש להם שני מאפיינים של תאי גזע HNSCC אחרים כלומר רמת ביטוי גבוהה של הסמן על פני קרום התא CD44 (CD44 גבוה) ואת יתר ביטוי של דהידרוגנז אלדהיד (ALDH גבוהה). מאז שימוש סמן יחיד יש מגבלות רבות ואת חסרונות עבור הבידוד של CSCS, השילוב של SP, CD44 וסמני ALDH יספקו כלי שימושי כדי לבודד CSCS עבור מבחני אנליטית נוספים ופונקציונליים הדורשים תאי קיימא. המאפיינים דמוי גזע של CSCS שקיבל תוקף ולבסוף במבחנה כתוצאה מהיווצרותם של tumorispheres ואת הבעת-קטנין β.
ראש תא צוואר קשקש קרצינומה (HNSCC) היא סרטן נפוץ ברחבי העולם ולמרות התקדמות טיפולים שוטפים, חולים עם מחלה מתקדמת בעלות פרוגנוזה נמוכה. שיעור ההישרדות של 5 שנים הכוללת של המטופל הוא סביב 30% למרות השילוב של גישות טיפוליות כוללים ניתוחים, כימותרפיה והקרנות-וממוקדים-טיפולים. מחקרים שנעשה לאחרונה מייחסים הישנות מקומיים גרורות מרוחקות להישרדות של תאי גזע דמוי סרטן (CSCS) בעקבות טיפולים נגד סרטן 1. יש עדויות מצטברות התומכים בקיומה של תאים מציגי המאפיינים תאי גזע (מעמד מובחן, יכולות התחדשות עצמית והבחנה, ופעילות טלומרז) בגידולים מוצקים שונים כולל סרטן השד, המוח, הערמונית, הריאות, המעי הגס, לבלב, כבד ועור 2- 10. עם זאת, המקור של CSCS עדיין לא ברור 11,12. הם עשויים לנבוע שינוי ממאיר של תאי גזע נורמליים 3,13 או dedifferentiation של תאים סרטניים כי לרכוש תכונות CSCS דמוי 14,15. לכן, הבנת מסלולים ייחודיים הנוגעים CSCS תספק תובנה אבחון מוקדם וטיפול של HNSCC עמיד.
הוצע כי CSCS גם בעלי פנוטיפים עמיד כי להתחמק כימותרפיה והקרנות סטנדרטיות, וכתוצאה מכך ישנות גידול לעומת חלק הארי של תאים סרטניים 16-19 והם מקומיים לתוך היפוקסי נישות 20. גורמים רבים הוצעו על מנת להסביר התנגדויות אלה של CSCS, כגון נטיית קפאון, תיקון DNA משופר, מנגנוני בקרת מחזור התא למעלה מוסדר, ו רדיקלים חופשיים הדחה 21. יתר על כן, מספר מסלולים מולקולריים בשעור ניתן להפעיל באופן ספציפי CSCS 17. על מנת לשפר את הידע של CSCS עבור טיפולים במיקוד, אנו זקוקים שיטות אמינות לזיהוי והבידוד של CSCS, בשל ההטרוגניות של סמני תא הקשורות גזעסוגים שונים של סרטן 22.
בשנת HNSCC, גזע דמוי תאי ייזום גידולים בודדו מגידולים מטופלים העיקרי ידי מיון תאי מבטאי סמני CSC שונים (כגון ביטוי מובילים בזרימת תרופת 23, גבוה CD44, CD133 הנמוך CD24 גבוה, c-Met + פנוטיפ 10,24, 25, או ALDH גבוהה פעילות 26) או לטפח גידול מטופל עיקרי ליצירת squamospheres בעלי תכונות CSC. אף על פי כן, מספר squamospheres פוחתת באופן דרמטי לאחר שני קטעים, ובכך לתת גודל מדגם קטן עבור אפיון נוסף שלומד 27. לכן, מבחני חוץ גופייה החל שורות תאים ומבוססות הוא פתרון קל יותר לתכנן את ניסויים על מנת לשפר את הידע של CSCS.
מטרת מאמר זה היא להציע שיטה לבודד CSCS שורות תאים HNSCC באמצעות ניתוח תזרים cytometric multiparametricnd מיון התא. הביטוי של CD44 בקורלציה עם מספר מאפיינים CSCS כולל פעילות ALDH, אוכלוסייה סייד (SP) פנוטיפ, יכולת גיבוש אליפטית ו tumorigenicity משמשים לבודד ולאפיין תת-אוכלוסייה זו של CSCS. CD44, גליקופרוטאין על פני קרום התא, הוא מעורב הידבקות נדידת תאים. CD44 מבוטא בכמות גבוהה בגידולים רבים מוצק 28 CSCS, כולל במודלים סרטן הראש והצוואר 29-31. יתר על כן, תאים גבוהים CD44 יכולים ליצור in vivo גידול הטרוגנית בעוד תאים נמוכים CD44 יכול לא 10. את assay SP מבוסס על פוטנציאל ההפרש של תאים בזרימה לצבוע Hoechst 22 דרך קלטת מחייב ATP (ABC) המשפחה של חלבוני טרנספורטר overexpressed בתוך הממברנה CSC. assay זה כולל את השימוש של מעכבי טרנספורטר ABC כגון verapamil בדגימות שליטה. dehydrogenase אלדהיד (ALDH) הוא אנזים תאי כי הוא מעורב המרת רטינול RETחומצת inoic במהלך התמיינות תאי גזע מוקדם 25,26. תאים להפגין התנהגות תאי גזע דמוי ניכרת פעילות ALDH הגבוה HNSCC 26 ומספר מעט מאוד של תאים גבוהים ALDH מסוגלים ליצור גידולי in vivo 26,32.
השילוב של סמנים ומאפיינים אלה שימש בהצלחה על ידי אל e t ברטרנד. ללמוד את ההתנגדות במבחנה ובחי של CSCS אלה פוטון יון פחמן קרינה 19. התוצאות שלהם הראו בבירור כי השילוב של סמנים ומאפייני תאים שונים הם בררני יותר ללימודים שימושיים על אוכלוסיות HNSCC CSCS מאשר גישות חד סמן.
פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה עבור הבידוד המוצלח של CSCS משורת תאים ספציפית כי הוא ישים שורות תאי HNSCC אחרות. CSCS הראש והצוואר מבודד אז הם מתאימים לאפיון מולקולרי נוסף במבחנה ואימות פונקציונלית ידי השתלה בעכברי immunodeficient 19. עם זאת, כמה שינויים יכול להיבדק בהתאם הא?…
The authors have nothing to disclose.
We thank Thibault Andrieu and Sebastien Dussurgey from the Flow Cytometry Platform of UFR BioSciences Gerland-Lyon-Sud (UMS3444/US8) for their advice and help during our sorting. This work was achieved within the scientific framework of ETOILE and Labex-PRIMES (ANR-11LABX-0063).
Fetal Calf Serum Gold | GE Healthcare | A15-151 | |
Hydrocortisone water soluble | Sigma-Aldrich | H0396-100MG | |
Penicillin/Streptomycin 100 X | Dominique Dutscher | L0022-100 | |
DMEM | Gibco | 61965-026 | |
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I | Gibco | 31765-027 | |
EGF | Promega | G5021 | The solution must be prepared just before use because it is very unstable |
Heparin | StemcellTM Technologies | 7980 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | 14533 | Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
Verapamil hydrochloride | Sigma-Aldrich | V-4629 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3 |
Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4 |
ALDEFLUOR Kit | Stem Cell | 1700 | |
CD44-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-095-177 | |
IgG1-APC, human antibody | Miltenyi Biotech | 130-093-189 | |
Z1 coulter particle | Beckman Coulter | 6605698 | |
Optical microscope | Olympus | CKX31 | |
SQ20B cell line | Gift from the John Little’s Laboratory | – | |
FaDu cell line | ATCC | HTB-43 | |
Low anchorage plates | Thermo Fischer Scientific | 145383 | |
BD FACSDiva software v8.0.1 | BD Biosciences | – |