Aislamiento y caracterización de un cabeza y cuello Carcinoma de células escamosas subpoblaciones Tener madre Características de las células

Summary

Understanding the role of cancer stem-like cells in tumor recurrence and resistance to therapies has become a topic of great interest in the last decade. This article describes the isolation and characterization of the sub-population of cancer stem-like cells from head and neck squamous carcinoma cell lines (HNSCC).

Abstract

A pesar de los avances en la comprensión de la cabeza y el cuello carcinomas de células escamosas (HNSCC) la progresión, la tasa de supervivencia de cinco años sigue siendo baja debido a la recurrencia local y metástasis a distancia. Una hipótesis para explicar esta recurrencia es la presencia de células madre, como el cáncer (CSC) que presentan la quimio y la radio inherente resistencia. Con el fin de desarrollar nuevas estrategias terapéuticas, es necesario disponer de modelos experimentales que validan la eficacia de los tratamientos específicos y, por tanto, disponer de métodos fiables para la identificación y aislamiento de células madre cancerosas. Con este fin, se presenta un protocolo para el aislamiento de células madre cancerosas de las líneas celulares HNSCC humanos que se basa en la combinación de dos granulometrías sucesivas de células realizadas por células activadas por fluorescencia (FACS). El primero de ellos se basa en la propiedad de los CAC a sobreexpresan ATP vinculante cassette (ABC) transportador de proteínas y por lo tanto excluye, entre otros, los tintes de ADN vitales tales como Hoechst 33342. Las células clasificadas con THSe método se identifica como una "población lado" (SP). A medida que las células SP representan un porcentaje bajo (<5%) de las células parentales, es necesario una fase de crecimiento con el fin de aumentar su número antes de la segunda clasificación de células. El siguiente paso permite la selección de células que poseen otras dos características de células madre HNSCC, es decir, alto nivel de expresión del marcador de superficie celular CD44 (CD44 ^alta) y la sobreexpresión de aldehído deshidrogenasa (ALDH ^alto). Dado que el uso de un único marcador tiene numerosas limitaciones y dificultades para el aislamiento de células madre cancerosas, la combinación de SP, CD44 y marcadores ALDH proporcionarán una herramienta útil para aislar células madre cancerosas para más ensayos analíticos y funcionales que requieren células viables. Las características madre-como de los CAC fue finalmente validadas in vitro mediante la formación de tumorispheres y la expresión de β-catenina.

Introduction

Cabeza y cuello carcinoma de células escamosas (HNSCC) es una enfermedad común en todo el mundo ya pesar de los avances en los tratamientos actuales, los pacientes con enfermedad avanzada tienen un mal pronóstico. La tasa de supervivencia 5 años general del paciente es de alrededor de 30% a pesar de la combinación de enfoques terapéuticos que incluyen la cirugía, la radioterapia y la quimioterapia-terapias dirigidas. Estudios recientes atribuyen recurrencia local y metástasis a distancia para la supervivencia de las células madre, como el cáncer (CSC) siguiendo las terapias contra el cáncer ^1. Hay evidencia acumulada apoya la existencia de células que presentan propiedades de células madre (capacidades de estado indiferenciado, auto-renovación y la diferenciación, y la actividad telomerasa) en diversos tumores sólidos incluyendo cáncer de mama, cerebro, próstata, pulmón, colon, páncreas, hígado y piel ^{2- 10.} Sin embargo, el origen de los CAC no está claro ^11,12. Ellos pueden ser el resultado de la transformación maligna de las células madre normales o ^3,13 dedifferenciación de las células tumorales que adquieren características CSC-como ^14,15. Por lo tanto, la comprensión de las vías de distintivos relacionados con CSC proporcionará información sobre el diagnóstico y el tratamiento de HNSCC resistente temprano.

Se ha propuesto que los CAC también poseen fenotipos resistentes que evaden la quimioterapia y la radioterapia estándar, lo que resulta en la recaída del tumor en comparación con la mayor parte de las células tumorales ^16-19 y se localizan en hipóxica nichos ^20. Se han propuesto numerosos factores para explicar estas resistencias de células madre cancerosas, tales como propensión a la inactividad, mejorado de reparación del ADN, hasta reguladas mecanismos de control del ciclo celular, y la eliminación de radicales libres ^21. Por otra parte, varias vías moleculares oncogénicas pueden activarse específicamente en los CAC ^17. Con el fin de mejorar el conocimiento de los CAC para terapias selectivas, necesitamos métodos fiables para la identificación y aislamiento de células madre cancerosas, debido a la heterogeneidad de los marcadores relacionados con las células madre envarios tipos de cánceres. ²²

En CECC, tallo-como las células iniciadoras de tumores han sido aislados de tumores de pacientes primaria clasificar células que expresan diferentes biomarcadores CSC (tales como transportadores de eflujo de fármaco expresión ^23, CD44 ^{alta, baja} CD24 CD133 ^alta, c-Met ^{+ 10,24 fenotipo, 25,} o ^{una alta} actividad de ALDH ²⁶⁾ o el cultivo de tumor primario del paciente para formar squamospheres que tienen propiedades CSC. Sin embargo, el número de squamospheres disminuye drásticamente después de dos pasos, dando así un tamaño pequeño de la muestra para una caracterización adicional estudia ^27. Por lo tanto, los ensayos in vitro a partir de líneas celulares bien establecidas es una solución más fácil de diseñar experimentos con el fin de mejorar el conocimiento de los CAC.

El objetivo de este artículo es proponer un método para aislar células madre cancerosas a partir de líneas celulares HNSCC utilizando el análisis de citometría de flujo multiparamétrica unand clasificación de células. La expresión de CD44 en correlación con varias propiedades CSC incluyendo la actividad de ALDH, Side Población (SP) fenotipo, la capacidad y la formación de esferoides tumorigenicidad se utilizan para aislar y caracterizar esta subpoblación de células madre cancerosas. CD44, una glicoproteína de superficie celular, está implicada en la adhesión celular y la migración. CD44 se expresa altamente en muchos tumores sólidos los CAC ^28, incluso en modelos de cáncer de cabeza y cuello ^29-31. Por otra parte, las células CD44 ^altas pueden generar in vivo un tumor heterogéneo mientras que las células CD44 ^bajas no pueden ^10. El ensayo SP se basa en el potencial diferencial de las células para flujo de salida el colorante Hoechst ²² a través de la familia de casete de unión a ATP (ABC) de proteínas transportadoras sobreexpresados ​​dentro de la membrana CSC. Este ensayo incluye el uso de inhibidores del transportador ABC como verapamilo en muestras de control. Aldehído deshidrogenasa (ALDH) es una enzima intracelular que está implicada en la conversión de retinol a retácido inoic durante la diferenciación de células madre al comienzo ^25,26. Las células que presentan actividad muestran el comportamiento de células madre similares a alta ALDH en HNSCC ²⁶ y un número muy limitado de células de ^alta ALDH son capaces de generar tumores in vivo ^26,32.

La combinación de estos marcadores y propiedades se utilizó con éxito por Bertrand e t al. Para estudiar la resistencia in vitro e in vivo de estas células madre cancerosas a la radiación de fotones y ¹⁹ de iones de carbono. Sus resultados mostraron claramente que la combinación de varios marcadores de células y las propiedades son más selectivos para los estudios útiles en poblaciones CECC CSC que los enfoques de un solo marcador.

Protocol

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices locales en el cuidado de animales. Todos los detalles de este estudio fueron aprobados por el CECCAPP, un comité de ética francés. 1. La selección de un lado la población (SP) por el colorante Hoechst Ensayo de eflujo La tinción 50 millones de células con Hoechst 33342. Se preparan dos tubos de 15 ml estériles con un fondo cónico: un tubo etiquetado "Hoechst" y la otra "Hoechst y …

Representative Results

El aislamiento de células madre cancerosas a partir de líneas celulares HNSCC requiere dos ordenación sucesiva debido a la muy bajo porcentaje de células madre cancerosas en la línea celular de sus padres. La primera clasificación se basa en la capacidad de CSC para excluir el colorante Hoechst debido a transportadores de eflujo de fármacos. Esto dio como resultado la adquisición de 1-5% de la población celular total ordenado (Figura 1). Durante el colorante Hoe…

Discussion

Este protocolo describe un método fiable para el aislamiento con éxito de células madre cancerosas de una línea celular específica que es aplicable a otras líneas celulares HNSCC. Aislado CSC cabeza y cuello son entonces adecuado para la caracterización molecular más in vitro y validación funcional de trasplante en ratones inmunodeficientes ^19. Sin embargo, algunas modificaciones pueden ser probados en función de la población lado o los ^{de alta} / ALDH ^altos porcentaje…

Materials

Fetal Calf Serum Gold	GE Healthcare	A15-151
Hydrocortisone water soluble	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicillin/Streptomycin 100 X	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1X) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	The solution must be prepared just before use because it is very unstable
Heparin	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosive, acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
Verapamil hydrochloride	Sigma-Aldrich	V-4629	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 3
Propidium Iodide	Sigma-Aldrich	P4170	Acute toxicity (oral, dermal, inhalation) category 4
ALDEFLUOR Kit	Stem Cell	1700
CD44-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, human antibody	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 coulter particle	Beckman Coulter	6605698
Optical microscope	Olympus	CKX31
SQ20B cell line	Gift from the John Little’s Laboratory	–
FaDu cell line	ATCC	HTB-43
Low anchorage plates	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biosciences	–