ヒト胆汁からマイクロRNA含有エキソソームの単離とプロファイリング
Summary
Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
Abstract
最後の3年間のエキソソームの研究は大幅にバイオマーカーとその治療用途の同定および特徴付けに向けて範囲を拡張しました。
エキソソームは、最近、マイクロRNA（のmiR）を含有することが示されています。 MIRS自体は、診断目的のための貴重なバイオマーカーとして生じています。診療所や病院での検体採取が非常に可変であるように、全体の胆汁からのmiRNA分離は、実質的に変化します。簡単な方法で収集され胆汁サンプルから、ロバスト正確で再現性のmiRNAプロファイルを達成するために胆汁からエキソソームを単離し、特徴づけるために、高品質のプロトコルの開発を必要としました。方法は、いくつかの遠心分離および単離されたエキソソームをペレット化し、最終的な超遠心分離ステップで濾過工程を必要とします。電子顕微鏡、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーおよびマルチパラメータナノ粒子の光学分析、電子の品質を検証するための重要な特性評価ステップである利用可能xosomes。これらのエキソソームからのmiRNAの単離のために、 線虫（Caenorhabditis elegans）のような種から非特異的、合成miRNAで溶解液をスパイク、 すなわち 、CEL-のmiR-39は、RNA抽出効率の正規化のために重要です。この方法以下の胆汁液からのエキソソームの単離に成功したmiRNAは-80℃で数年間保存胆汁サンプルからプロファイリングできます。
Introduction
他の生物学的流体、すなわち、母乳、血漿または尿のように、胆汁はエキソソーム、脂質の豊富な小胞1-4が含まれています 。エキソソームは、誘導または受容細胞5、6、彼らの正常な機能4、7-9の一部である可能性があります細胞間コミュニケーションの形で生物学的機能を変化させることができます。エキソソームは、診断10のためのバイオマーカーの貴重な情報源を提供することができmiRNA種を含むことができます。 miRNAプロファイルは、疾患11-14の様々な診断および予後マーカーとして、近年かなりの注目を集めています。
miRNA自体は、おそらく死細胞により放出され、脱落細胞の量が大幅に基礎疾患によって影響を受けることができ、生物学的流体中に見出すことができます。エキソソームのmiRNAプロファイルは、必ずしも元のセル6、10、15から17のmiRNAプロファイルを反映していない、まだエキソソームは、親CEの特徴であるかもしれないのmiRNAの署名を運ぶことができます腫瘍細胞が好きでしょう。腫瘍由来エキソソームは、肺腺癌、前立腺癌および他の腫瘍8、16、18の患者の血漿中で同定されています。
この方法の目的は、彼らの前処理手順の大部分は独立したヒト胆汁標本からのエキソソームの信頼性の高い堅牢な単離であります。このような胆管19と胆管の疾患の潜在的な診断のためのmiRNAの信頼できる情報源としての胆汁を利用するために開発されました。これは、エキソソームを単離するために、速度の増加に伴って、遠心分離のいくつかのステップで構成され、他の生物学的流体に適用できる可能性があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
確実胆汁から単離したエキソソームを利用するためには、引き換えに、高品質のサンプルを得るために、一貫した高品質の単離方法を用いることが重要です。本論文で定義された方法論は、ヒト胆汁からエキソソームとのmiRNAを単離するための十分に確立された方法です。これは、最低でも電子顕微鏡やナノ粒子の光学分析とウェスタンブロットを含むべきである単離されたエキソソームの?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
Materials
| 0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
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