Microinjection لTransgenesis والجينوم التحرير في Threespine أبو شوكة
Summary
التلاعب المعدلة وراثيا وتحرير الجينوم حاسمة لاختبار وظيفيا دور الجينات وعناصر -regulatory رابطة الدول المستقلة. هنا يرد بروتوكول حقن مكروي مفصل لتوليد التعديلات الجينوم (بما في ذلك بوساطة Tol2-بنيات فلوري مراسل التحوير، TALENs، وCRISPRs) للأسماك نموذج الناشئة، وأبو شوكة سمك شائك threespine.
Abstract
وقد ظهرت الأسماك أبو شوكة سمك شائك threespine كنظام قوي لدراسة الأساس الجيني لمجموعة واسعة من المورفولوجية والفسيولوجية، والظواهر السلوكية. الظواهر المتنوعة بشكل ملحوظ والتي تطورت كما التكيف مع السكان البحري إلى بيئات المياه العذبة لا تعد ولا تحصى، جنبا إلى جنب مع القدرة على عبور أشكال البحرية والمياه العذبة، وتوفير نظام الفقاريات نادرة في علم الوراثة التي يمكن استخدامها لرسم خريطة مناطق الجينوم سيطرة على وصفات تطورت. هي الموارد الجينومية الممتازة المتاحة الآن، وتسهيل تشريح الوراثي الجزيئي للتغييرات تطورت. بينما التجارب رسم الخرائط توليد قوائم الجينات المرشحة للاهتمام، يطلب من التلاعب الجيني وظيفية لاختبار دور هذه الجينات. تنظيم الجينات يمكن دراستها مع البلازميدات مراسل المعدلة وراثيا والبكالوريا دمجها في الجينوم باستخدام نظام ترانسبوزاز Tol2. وظائف الجينات المرشحة محددة وعناصر -regulatory رابطة الدول المستقلة يمكن تقييمها عن طريق حفز المستهدفةالطفرات مع TALEN وكريسبر / Cas9 الكواشف تحرير الجينوم. كل الطرق تتطلب بإدخال الأحماض النووية إلى المخصبة الأجنة أبو شوكة سمك شائك-خلية واحدة، وهي مهمة صعبة من قبل المشيمه سميكة من الأجنة أبو شوكة سمك شائك وقسيم أرومي صغير نسبيا ورقيقة. هنا، يتم وصف بروتوكول مفصلة ل microinjection من الأحماض النووية في الأجنة أبو شوكة سمك شائك للالمعدلة وراثيا وتحرير الجينوم التطبيقات لدراسة التعبير الجيني وظيفة، فضلا عن التقنيات المستخدمة لتقييم نجاح transgenesis واستعادة خطوط مستقرة.
Introduction
واحد عنصرا أساسيا في فهم الكيفية التي ينشأ التنوع البيولوجي هو تحديد الأسباب الوراثية والتنموية التغيرات المظهرية تطورت في الطبيعة. الأسماك أبو شوكة سمك شائك threespine، Gasterosteus aculeatus، برزت نموذجا ممتازا لدراسة الأساس الجيني للتطور. خضعت أبو شوكة العديد من التغيرات التطورية التكيف على الأسماك البحرية قد استعمرت عدد لا يحصى من بيئات المياه العذبة في جميع أنحاء نصف الكرة الشمالي، مما أدى إلى الصرفية مثيرة والفسيولوجية، والتغيرات السلوكية 1. تم التسلسل جينومات أفراد من واحد وعشرين السكان أبو شوكة سمك شائك وتجميعها، ولقد تم إنشاء خريطة الربط عالية الكثافة لزيادة تحسين تجمع 2،3. وقد حددت التجارب رسم الخرائط الوراثية مناطق الجينوم الكامنة وراء الظواهر تطورت 4-6، وفي حالات قليلة، تم اختبار الأدوار الوظيفية من الجينات المرشحة محددة 7،8. وقد تم التعرف على عدد من مناطق الجينوم الكامنة وراء التغيرات المورفولوجية مع الجينات مرشح واعد، ولكن هؤلاء المرشحين لم يتم اختبارها وظيفيا 9-12. وبالإضافة إلى ذلك، أبو شوكة هي نماذج مشتركة لدراسات علم الوراثة السكانية / علم الجينوم 13،14، أنواع جديدة 15، والسلوك 1، الغدد الصماء 16، والسمية الإيكولوجية 17، علم المناعة 18 والطفيليات 19. والدراسات المستقبلية في كل من هذه المجالات تستفيد من القدرة على أداء التلاعب الجيني وظيفية في أبو شوكة. بالإضافة إلى التلاعب تسلسل الترميز، ودور الجينات المرشحة يمكن تقييم من خلال دراسة تسلسل -regulatory رابطة الدول المستقلة وعن طريق زيادة وظيفيا أو الخفض، أو القضاء على التعبير عن الجينات مرشح. طرق حقن مكروي وtransgenesis في أبو شوكة راسخة 7،8،20 ووضعت في البداية باستخدام بوساطة meganucleaseطريقة 21 صفت لأول مرة في الميداكا 22. وقد تم تحسين طريقة حقن مكروي المعدلة المعروضة هنا لكل من transgenesis توسط Tol2 وضعت مؤخرا الجينوم الكواشف التحرير بما في ذلك TALENs وCRISPRs.
ويعتقد أن التغييرات في العناصر رابطة الدول المستقلة -regulatory أن تكون حاسمة في تطور المورفولوجية، ورابطة الدول المستقلة -regulatory التغييرات يمكن تجنب العواقب عديد المظاهر السلبية للترميز الطفرات 23. ولذلك، أصبح اختبار ومقارنة المفترضة تسلسل -regulatory رابطة الدول المستقلة هدفا مركزيا لعدد متزايد من الدراسات التطورية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم المتغيرات الأمراض البشرية هي المتغيرات التنظيمية 24،25، ونظم نموذج الفقاريات هناك حاجة ماسة لدراسة رابطة الدول المستقلة وظيفة عنصر -regulatory والمنطق. الأسماك التي تخصيب الأجنة من الخارج بأعداد كبيرة ويعطي نظم الفقاريات قوية لدراسة -regulation رابطة الدول المستقلة. النظام ينقول Tol2، التي foreiويحيط الحمض النووي حسن الجوار لتكون متكاملة في الجينوم من Tol2 ترانسبوزاز المواقع وملزمة شارك حقنه مع Tol2 ترانسبوزاز مرنا، تعمل بكفاءة عالية لدمج بنجاح البلازميد يبني في الجينوم الأسماك 26-28. عادة، يتم استنساخ محسن محتمل المنبع المروج القاعدية (مثل hsp70l 29) والجينات مراسل فلوري مثل EGFP (تعزيز البروتين الفلوري الأخضر) أو mCherry في العمود الفقري Tol2 وحقن ترانسبوزاز مرنا 26. توفر المراقبة التعبير لمراسل الفلورسنت، سواء في الأجنة المحقونة أو ذرية مع الجينات المحورة المتكاملة مستقر، معلومات عن تنظيم الزمانية المكانية في التعبير الجيني يقودها محسن المفترضة. في تجارب أخرى، والقدرة على التحقق من صحة يمكن استخدامها لدفع overexpression الأنسجة محددة من الجينات في المصالح.
لتحليل المناطق -regulatory رابطة الدول المستقلة أكبر، جودة عالية إدراج كبير genomتم تشييد مكتبات جيم باستخدام الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية (البكالوريا) لكل من أبو شوكة البحرية والمياه العذبة 30. يمكن recombineered هذه البكالوريا لتحل محل الجينات مع الجينات مراسل فلوري في سياق واسع (150-200 كيلو بايت) المنطقة الجينومية 31. ثم يتم التعبير عن مراسل فلوري في نمط الزمانية المكانية على النحو الذي يحدده تسلسل التنظيمية داخل BAC. للدراسات في الأسماك، يمكن إضافة مواقع Tol2 إلى BAC لتسهيل التكامل الجيني 32،33. في مراحل لاحقة من التطور عند التهجين الموضعي يشكل تحديا تقنيا، قراءات الفلورسنت من BAC يمكن استخدامها لدراسة أنماط التعبير الجيني، كما ثبت عن أبو شوكة سمك شائك العظام البروتين المخلق 6 (Bmp6) 20. بالإضافة إلى ذلك، يمكن تتبع أنماط التعبير الفلورسنت في الفرد مع مرور الوقت، والتي لا يمكن أن يتحقق مع التهجين في الموقع. ويمكن أيضا أن تستخدم البكالوريا لإضافة additionaنسخة لتر من منطقة الجينومية لزيادة جرعة من الجينات في المصالح.
لدراسة وظيفة الجين، والتحرير الجينوم هو حقل التوسع المتفجرات التي يمكن استخدامها لإحداث تغييرات هادفة لتسلسل الجينوم في مجموعة متنوعة واسعة من الكائنات الحية 34. النسخ الشبيهة المنشط nucleases المستجيب (TALENs) هي وحدات، وتسلسل معين nucleases فصل أصلا من مسببات الأمراض النباتية التي يمكن تصميمها بدقة لربط مباشرة إلى التسلسل الجيني الاختيار وتوليد حبلا مزدوج كسر 35،36. تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / تم العثور على أنظمة CAS أصلا في البكتيريا واستخدام الحمض النووي الريبي دليل والبروتين Cas9 لتوليد كسر في الهدف تسلسل الحمض النووي مكملة لدليل 37. إصلاح لاحق من نهاية الشوط الاول حبلا مزدوج إنشاؤها من قبل كل من TALENs وCRISPRs غالبا ما يترك وراءه الإدراج صغير أو الحذف، والذي يمكن أن يحدث خللا في وظيفة من تسلسل الهدف35-37. في أبو شوكة، وقد استخدمت TALENs لعرقلة التعبير الجيني من خلال استهداف محسن 20، وكلا TALENs وCRISPRs نجحنا في انتاج طفرات في الترميز متواليات (بيانات غير منشورة). بروتوكول مفصل لتوليد CRISPRs للاستخدام في الزرد يمكن أن تستخدم كدليل لتطوير CRISPRs لأبو شوكة 38.
تتطلب المعدلة وراثيا والجينوم التجارب التحرير مقدمة من الأحماض النووية إلى المخصبة حديثا الجنين خلية واحدة. من خلال إدخال التحوير أو الجينوم تحرير أداة في التنمية في وقت مبكر، إلى أقصى حد ممكن من عدد الخلايا ابنة التلاعب بها وراثيا في الجنين. حقن الأجنة ثم يتم بصريا فحص لمضان أو فحص جزيئيا عن التعديلات الجينوم. إذا استهدفت خلايا المساهمة في سلالة الجرثومية بنجاح، والتحوير أو طفرة يمكن أن تنتقل إلى مجموعة فرعية من النسل، حتى عندما بعد الحقن الفتك عالية. الأسماك الفسيفساء يمكن outcrossed أوintercrossed وذريتهم فحص لاسترداد أليل متحولة أو التحوير متكاملة ثابت من الفائدة. يصف هذا البروتوكول طرق لإدخال الجينات المحورة والجينوم الكواشف التحرير في الأجنة أبو شوكة سمك شائك-خلية واحدة ورصد التعديلات الجينوم ناجحة.
Protocol
Representative Results
Discussion
حقن الأجنة أبو شوكة سمك شائك-خلية واحدة لtransgenesis أو تحرير الجينوم تقدم ثلاثة تحديات رئيسية. أولا، بالنسبة للأجنة الزرد، والمشيمه أبو شوكة سمك شائك الجنينية صعبة، وكثيرا ما كسر الإبر. ويمكن التغلب على هذه المشكلة جزئيا باستخدام بال micropipettes سمكا وأقوى الزجاج وحقن عمودي…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة R01 # DE021475 (CTM)، والمعاهد الوطنية للصحة دكتوراه مسبقا التدريب غرانت 5T32GM007127 (PAE)، وجبهة الخلاص الوطني العليا زمالة أبحاث (دار الوثائق القومية). نشكر كيفن Schwalbach لأداء recombineering BAC والحقن، نيك دوندي لتوليد تسلسل البيانات كريسبر سانجر، وكاثرين ليباري لتغذية راجعة مفيدة على بروتوكول الحقن.
Materials
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | – | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 x 10mm petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50X Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10KbRNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10X PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
Referenzen
- Bell, M. A., Foster, S. A. . The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).
- Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
- Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetik. 197 (1), 405-420 (2014).
- Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
- Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- O’Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
- Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
- Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
- McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
- Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
- Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
- Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
- Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
- Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning a laboratory manual. , (2012).
- Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , (2007).
- Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
