Micro-injectie voor Transgenese en Genome Bewerken in Threespine Stekelbaarzen
Summary
Transgene manipulaties en genoom editing zijn van cruciaal belang voor het functioneel testen van de rol van genen en cis van regelgevende elementen. Hier kunt u een gedetailleerde micro-injectie protocol voor het genereren van genomische modificaties (inclusief Tol2-gemedieerde fluorescerende reporter transgene constructen, Talens en CRISPRs) wordt gepresenteerd voor de opkomende model vis, de driedoornige stekelbaars.
Abstract
De driedoornige stekelbaars vis zich ontwikkeld tot een krachtig systeem om de genetische basis van uiteenlopende morfologische, fysiologische bestuderen en gedragsmatige fenotypes. De opmerkelijk verschillende fenotypen die zijn geëvolueerd mariene populaties passen aan talloze zoetwatermilieus, gecombineerd met de mogelijkheid mariene en zoetwater vormen kruisen, vormen een zeldzame vertebraat systeem waarin genetica kan worden gebruikt om genomische regio kaart besturen geëvolueerd eigenschappen. Uitstekende genomische middelen zijn nu beschikbaar, het vergemakkelijken van moleculair genetische dissectie van geëvolueerd veranderingen. Terwijl mapping experimenten genereren van lijsten van interessante kandidaatgenen zijn functionele genetische manipulaties nodig om de rol van deze genen te testen. Genregulatie kan worden bestudeerd met transgene reporter plasmiden en BACs geïntegreerd in het genoom via het transposase Tol2 systeem. Functies van specifieke kandidaat-genen en cis-elementen van regelgevende kan worden beoordeeld door het induceren gerichtmutaties met TALEN en CRISPR / Cas9 genoom bewerken reagentia. Alle methoden vereisen introduceren van nucleïnezuren in bevruchte één-cel stekelbaars embryo's, een taak moeilijker geworden door de dikke chorion van stekelbaars embryo's en de relatief klein en dun blastomere. Hier is een gedetailleerd protocol voor micro-injectie van nucleïnezuren in stickleback embryo beschreven transgene genoom en bewerkingssoftware om genexpressie en functie te bestuderen, alsook technieken voor het succes van transgenese beoordelen en herstellen stabiele lijnen.
Introduction
Een fundamenteel onderdeel van het begrip van hoe biodiversiteit ontstaat is het bepalen van de genetische en ontwikkelingsstoornissen bases van geëvolueerd fenotypische veranderingen in de natuur. De driedoornige stekelbaars vis, Gasterosteus aculeatus, heeft ontpopt als een uitstekend model voor het bestuderen van de genetische basis van de evolutie. Stekelbaarzen hebben veel adaptieve evolutionaire veranderingen ondergaan zeevissen talloze zoetwater omgevingen gekoloniseerd rond het noordelijk halfrond, wat resulteert in dramatische morfologische, fysiologische en gedragsveranderingen 1. De genomen van individuen 20-1 stickleback populaties werden gesequenced en geassembleerd, en een hoge dichtheid koppelingskaart werd gegenereerd om het samenstel te verbeteren 2,3. Genetische mapping experimenten hebben genomische regio's die ten grondslag liggen aan geëvolueerd fenotypes 4-6, en in een paar gevallen zijn de functionele rol van specifieke kandidaat-genen getest 7,8. Een aantal genoomgebieden onderliggende morfologische veranderingen werden geïdentificeerd met veelbelovende kandidaat-genen, maar deze kandidaten nog niet functioneel getest 9-12. Bovendien, stekelbaars zijn gangbare modellen voor studies van de bevolking genetica / genomics 13,14, soortvorming 15, gedrag 1, endocrinologie 16, ecotoxicologie 17, immunologie en parasitologie 18 19. Toekomstige studies in elk van deze gebieden zullen profiteren van de mogelijkheid om functionele genetische manipulaties in sticklebacks. Naast het manipuleren van hun coderende sequenties, kan de rol van kandidaatgenen worden geëvalueerd door het bestuderen van hun cis van regelgevende sequenties en functioneel toenemen, afnemen of elimineren van expressie van het kandidaatgen. Micro-injectie en transgenese methoden in stekelbaars zijn goed ingeburgerd 7,8,20 en werden in eerste instantie ontwikkeld met behulp van een meganuclease bemiddeldeWerkwijze 21 eerst beschreven in medaka 22. De gemodificeerde micro-injectie hier gepresenteerde methode is geoptimaliseerd voor zowel Tol2 gemedieerde transgenese en recent ontwikkelde genoom bewerken reagentia met inbegrip van Talens en CRISPRs.
Wijzigingen in cis van regelgevende elementen worden gedacht van cruciaal belang voor morfologische evolutie te zijn, zoals cis van regelgevende veranderingen die de negatieve gevolgen van pleiotrope codering mutaties 23 kunnen voorkomen. Daarom is het testen en vergelijken van vermeende cis van regelgevende sequenties is uitgegroeid tot een centrale doelstelling van een toenemend aantal evolutionaire studies. Daarnaast hebben de meeste menselijke ziekten varianten zijn regulerende varianten 24,25, en het model gewervelde systemen zijn hard nodig om cis van regelgevende element functie en logica te bestuderen. Vissen die hun embryo's extern bemesten in grote aantallen bieden krachtige gewervelde systemen om cis -regeling te bestuderen. Het Tol2 transposon systeem, waarbij buign DNA te integreren in het genoom wordt geflankeerd door Tol2 transposase bindingsplaatsen en co-geïnjecteerd met Tol2 transposase mRNA, werkt met hoge werkingsgraad voor succesvolle integratie plasmide constructen in fish genoom 26-28. Typisch wordt een mogelijke enhancer gekloneerd stroomopwaarts van een basale promotor (zoals hsp70l 29) en fluorescerende reportergen zoals EGFP (verhoogd groen fluorescent eiwit) of mCherry in een Tol2 hoofdketen en geïnjecteerd met transposase mRNA 26. Waarneming van expressie van het fluorescerende reporter, hetzij geïnjecteerde embryo's of nakomelingen met stabiel geïntegreerde transgenen, geeft informatie over de spatio-temporale regulatie van genexpressie aangedreven door de vermoedelijke enhancer. In verdere experimenten, kan bevestigd versterkers worden gebruikt om weefselspecifieke overexpressie van genen van belang drijven.
Voor de analyse van grotere cis van regelgevende regio's, van hoge kwaliteit met grote insert genomic bibliotheken met behulp van bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC) zijn gebouwd voor zowel zee- en zoetwater stekelbaars 30. Deze BACs kunnen worden recombineered een gen te vervangen door een fluorescerende reporter gen in de context van een groot (150-200 kb) genomisch gebied 31. De fluorescerende reporter wordt vervolgens uitgedrukt in een spatiotemporele patroon, zoals bepaald door de regelgevende sequenties binnen de BAC. Voor studies in vis, kan Tol2 locaties worden toegevoegd aan de BAC op genomische integratie 32,33 vergemakkelijken. In latere stadia van ontwikkeling in situ hybridisatie technisch uitdagend, kan de fluorescentie van de BAC worden gebruikt om patronen van genexpressie te bestuderen, zoals is getoond stickleback Bone morfogenetisch eiwit 6 (BMP6) 20. Bovendien kunnen fluorescerende expressiepatronen bij een individu worden gevolgd in de tijd, die niet kan worden bereikt met in situ hybridisatie. BAC's kunnen ook worden gebruikt om een additiona toevoegenl kopie van een genomisch gebied de dosering van een gen van belang te verhogen.
Voor het onderzoek van genfunctie, genoom bewerken is een explosief groeiende sector die kan worden gebruikt om gerichte wijzigingen genomische sequenties in diverse organismen 34 te produceren. Transcriptie activator-achtige effector nucleasen (Talens) zijn modulair, sequentie-specifieke nucleasen oorspronkelijk geïsoleerd uit plantaardige pathogenen die nauwkeurig kan worden ontworpen om direct te binden aan een genoomsequentie van de keuze en het genereren van een dubbele streng te breken 35,36. Geclusterde regelmatig afstand van elkaar korte palindroom repeats (CRISPR) / CAS werden oorspronkelijk gevonden in bacteriën en gebruik een gids-RNA en eiwit Cas9 om een breuk in een doel DNA sequentie complementair aan de geleiding 37 te genereren. De daaropvolgende reparatie van de dubbelstrengbreuk door zowel Talens en CRISPRs vaak laat een kleine insertie of deletie, waarbij de functie van de doelsequentie kunnen verstoren35-37. In sticklebacks zijn Talens gebruikt om genexpressie ontwrichten via manipulatie van een versterker 20, en beide Talens en CRISPRs met succes geproduceerd coderende mutaties (ongepubliceerde gegevens). Een gedetailleerd protocol voor het genereren van CRISPRs voor gebruik in zebravis kan worden gebruikt als richtlijn om CRISPRs voor stekelbaarsjes 38 ontwikkelen.
Transgene en genoom bewerken experimenten vereisen invoering van nucleïnezuren in een pasbevruchte eencellige embryo. Door het inbrengen van het transgen of genoom-editing tool vroeg in de ontwikkeling, is het aantal genetisch gemanipuleerde dochtercellen in het embryo gemaximaliseerd. Geïnjecteerde embryo's worden vervolgens visueel onderzocht op fluorescentie of moleculair gescreend genoom wijzigingen. Als cellen die bijdragen tot de kiemlijn succesvol zijn gericht, kan het transgen of mutatie worden doorgegeven aan een subset van nakomelingen, zelfs wanneer na injectie dodelijkheid hoog. Het mozaïek vis kan worden outcrossed ofgekruist en hun nakomelingen gescreend om de mutant allelen of een stabiel geïntegreerd transgen van rente terug te vorderen. Dit protocol beschrijft methoden voor het introduceren van transgenen en genoom bewerken reagentia in één cel stekelbaars embryo's en het toezicht op voor een succesvolle genomische modificaties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het injecteren van een cel stekelbaars embryo's voor transgenese of genoom bewerken presenteert drie grote uitdagingen. In de eerste plaats ten opzichte van de zebravis embryo's, de stekelbaars embryonale chorion is taai en zal vaak breken naalden. Dit probleem kan gedeeltelijk worden ondervangen door dikker en sterker glazen micropipetten en injecteren loodrecht op het chorion (zie protocol figuur 2). Zorgen dat zo min mogelijk water wordt toegevoegd aan het embryo (net genoeg om de oorzaak cho…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd deels gefinancierd door de NIH R01 # DE021475 (CTM), een NIH predoctorale Training Grant 5T32GM007127 (PAE) en een NSF Graduate Research Fellowship (NAE). Wij danken Kevin Schwalbach voor het uitvoeren van BAC recombineering en injecties, Nick Donde voor het genereren van CRISPR Sanger sequencing data, en Katherine Lipari voor nuttige feedback over de injectie protocol.
Materials
| Stereomicroscope with transillumination | Leica | S6e/ KL300 LED | |
| Manual micromanipulator | Applied Scientific Instrumentation | MM33 | Marzhauser M33 Micromanipulator |
| Pressure Injecion system | Applied Scientific Instrumentation | MPPI-3 | |
| Back pressure unit | Applied Scientific Instrumentation | BPU | |
| Micropipette holder kit | Applied Scientific Instrumentation | MPIP | |
| Magnetic base holder | Applied Scientific Instrumentation | Magnetic base | |
| Foot switch | Applied Scientific Instrumentation | FSW | |
| Iron plate (magnetic base) | Narishige | IP | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| Disposable transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| 0.5% phenol red in DPBS | Sigma | P0290 | injection tracer |
| #5 forceps, biologie dumoxel | Fine Science Tools | 11252-30 | for needle breaking |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E210 | holds needles |
| 6", 6 teeth per inch plaster drywall saw | Lenox | 20571 (S636RP) | hold eggs for injection |
| 13 cm x 13 cm glass plate | any hardware store | – | |
| Borosilicate glass capillaries, 1.0 mm OD/0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100-F4 | *harder glass than zebrafish injection capillaries |
| 150 x 15mm petri dish | Fisher | FB0875714 | raise stickleback embryos |
| 35 x 10mm petri dish | Fisher | 08-757-100A | store eggs pre-injection |
| Instant Ocean Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761-500G | |
| Tricaine methanesulfonate/MS-222 | Western Chemical Inc | MS222 | fish anaesthesia/euthanasia |
| Sp6 transcription kit | Ambion | AM1340 | For transcription of TALENs and transposase mRNA |
| RNeasy cleanup kit | Qiagen | 74104 | purify transposase or TALEN RNA |
| QiaQuick PCR cleanup kit | Qiagen | 28104 | clean up plasmids for injection |
| Proteinase K 20 mg/ml | Ambion | AM2546 | for DNA preparation |
| Nucleobond BAC 100 kit | Clontech | 740579 | for BAC DNA preparation |
| NotI | NEB | R0189L | |
| Phusion polymerase | Fisher | F-530L | |
| Qiagen PlasmidPlus Midi kit | Qiagen | 12943 | contains endotoxin rinse buffer |
| QIAQuick Gel Extraction | Qiagen | 28704 | for sequencing induced mutations |
| Phenol:chloroform:Isoamyl alcohol | Sigma | P2069-100ML | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889-250G | |
| Ethanol (molecular biology grade) | Sigma | E7023-500ML | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| 50X Tris-acetate-EDTA buffer | ThermoFisher | B49 | |
| 0.5-10KbRNA ladder | ThermoFisher | 15623-200 | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | Nanodrop 2000 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127-500G | |
| 10X PBS | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1kb Plus DNA Ladder | ThermoFisher | 10787-018 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541-500G | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266-100G | |
| NP-40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379-500ML | |
| Tris pH 8.3 | Teknova | T1083 | |
| 12-strip PCR tube | Thermo Scientific | AB-1113 |
Referenzen
- Bell, M. A., Foster, S. A. . The Evolutionary Biology of the Threespine Stickleback. , (1994).
- Jones, F. C., et al. The genomic basis of adaptive evolution in threespine sticklebacks. Nature. 484 (7392), 55-61 (2012).
- Glazer, A. M., Killingbeck, E. E., Mitros, T., Rokhsar, D. S., Miller, C. T. Genome assembly improvement and mapping convergently evolved skeletal traits in sticklebacks with Genotyping-by-Sequencing. G3. 5 (7), 1463-1472 (2015).
- Miller, C. T., et al. Modular skeletal evolution in sticklebacks is controlled by additive and clustered quantitative trait Loci. Genetik. 197 (1), 405-420 (2014).
- Shapiro, M. D., et al. Genetic and developmental basis of evolutionary pelvic reduction in threespine sticklebacks. Nature. 428 (6984), 717-723 (2004).
- Colosimo, P. F., et al. Widespread parallel evolution in sticklebacks by repeated fixation of Ectodysplasin alleles. Science. 307 (5717), 1928-1933 (2005).
- Chan, Y. F., et al. Adaptive evolution of pelvic reduction in sticklebacks by recurrent deletion of a Pitx1 enhancer. Science. 327 (5963), 302-305 (2010).
- O’Brown, N. M., Summers, B. R., Jones, F. C., Brady, S. D., Kingsley, D. M. A recurrent regulatory change underlying altered expression and Wnt response of the stickleback armor plates gene EDA. eLife. , e05290 (2015).
- Cleves, P. A., et al. Evolved tooth gain in sticklebacks is associated with a cis-regulatory allele of Bmp6. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (38), 13912-13917 (2014).
- Erickson, P. A., Glazer, A. M., Cleves, P. A., Smith, A. S., Miller, C. T. Two developmentally temporal quantitative trait loci underlie convergent evolution of increased branchial bone length in sticklebacks. Proc. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 281 (1788), 20140822 (2014).
- Glazer, A. M., Cleves, P. A., Erickson, P. A., Lam, A. Y., Miller, C. T. Parallel developmental genetic features underlie stickleback gill raker evolution. EvoDevo. 5 (1), (2014).
- Ellis, N. A., et al. Distinct developmental and genetic mechanisms underlie convergently evolved tooth gain in sticklebacks. Development. 142, 2442-2451 (2015).
- Hohenlohe, P. A., Bassham, S., Currey, M., Cresko, W. A. Extensive linkage disequilibrium and parallel adaptive divergence across threespine stickleback genomes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 367 (1587), 395-408 (2012).
- Hohenlohe, P. A., et al. Population genomics of parallel adaptation in threespine stickleback using sequenced RAD tags. PLoS Genet. 6 (2), e1000862 (2010).
- McKinnon, J. S., Rundle, H. D. Speciation in nature: the threespine stickleback model systems. Trends Ecol. Evol. 17 (10), 480-488 (2002).
- Shao, Y. T., et al. Androgen feedback effects on LH and FSH, and photoperiodic control of reproduction in male three-spined sticklebacks, Gasterosteus aculeatus. Gen. Comp. Endocrinol. 182, 16-23 (2013).
- Katsiadaki, I., et al. Three-spined stickleback: an emerging model in environmental endocrine disruption. Environ. Sci. Int. J. Environ. Physiol. Toxicol. 14 (5), 263-283 (2007).
- Lenz, T. L., Eizaguirre, C., Rotter, B., Kalbe, M., Milinski, M. Exploring local immunological adaptation of two stickleback ecotypes by experimental infection and transcriptome-wide digital gene expression analysis. Mol. Ecol. 22 (3), 774-786 (2013).
- Barber, I. Sticklebacks as model hosts in ecological and evolutionary parasitology. Trends Parasitol. 29 (11), 556-566 (2013).
- Erickson, P. A., et al. A 190 base pair, TGF-β responsive tooth and fin enhancer is required for stickleback Bmp6 expression. Dev. Biol. 401 (2), 310-323 (2015).
- Hosemann, K. E., Colosimo, P. F., Summers, B. R., Kingsley, D. M. A simple and efficient microinjection protocol for making transgenic sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1345-1355 (2004).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech. Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Carroll, S. B. Evo-Devo and an expanding evolutionary synthesis: a genetic theory of morphological evolution. Cell. 134 (1), 25-36 (2008).
- Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
- Hindorff, L. A., et al. Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106 (23), 9362-9367 (2009).
- Fisher, S., et al. Evaluating the biological relevance of putative enhancers using Tol2 transposon-mediated transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 1 (3), 1297-1305 (2006).
- Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11403-11408 (2000).
- Kikuta, H., Kawakami, K. Transient and stable transgenesis using Tol2 transposon vectors. Methods in Moleculario Biology: Zebrafish. , 69-84 (2009).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Dev. Camb. Engl. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Kingsley, D. M., et al. New genomic tools for molecular studies of evolutionary change in threespine sticklebacks. Behaviour. 141 (11/12), 1331-1344 (2004).
- Mortlock, D. P., Guenther, C., Kingsley, D. M. A general approach for identifying distant regulatory elements applied to the Gdf6 gene. Genome Res. 13 (9), 2069-2081 (2003).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat. Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Suster, M. L., Sumiyama, K., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish and mice. BMC Genomics. 10 (1), 477 (2009).
- Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat. Rev. Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
- Cermak, T., et al. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting. Nucleic Acids Res. 39 (17), (2011).
- Miller, J. C., et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing. Nat. Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Talbot, J. C., Amacher, S. L. A streamlined CRISPR pipeline to reliably generate zebrafish frameshifting alleles. Zebrafish. 11 (6), 583-585 (2014).
- Kawakami, K., et al. A Transposon-Mediated Gene Trap Approach Identifies Developmentally Regulated Genes in Zebrafish. Dev. Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular cloning a laboratory manual. , (2012).
- Villefranc, J. A., Amigo, J., Lawson, N. D. Gateway compatible vectors for analysis of gene function in the zebrafish. Dev. Dyn. 236 (11), 3077-3087 (2007).
- Doyle, E. L., et al. TAL Effector-Nucleotide Targeter (TALE-NT) 2.0: tools for TAL effector design and target prediction. Nucleic Acids Res. 40 (W1), W117-W122 (2012).
- Untergasser, A., et al. Primer3-new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 40 (15), e115 (2012).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio) . , (2007).
- Dale, R. M., Topczewski, J. Identification of an evolutionarily conserved regulatory element of the zebrafish col2a1a. Dev. Biol. 357 (2), 518-531 (2011).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Qi, L. S., et al. Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of Gene expression. Cell. 152 (5), 1173-1183 (2013).
